REVIZUIRE BIBLIOGRAFICĂ A MICROORGANISMELOR DE BIODEGRADARE A POLIETILENULUI CU DENSITATE SCĂZUTĂ ȘI EFECTELE LOR PE MATERIAL Nelson Ricardo Acuña Molina FRANCISCO JOSE DE CALDAS DISTRICTUL UNIVERSITĂȚII FACULTATEA DE ȘTIINȚE ȘI EDUCAȚIE 2017

microorganismelor

REVIZUIRE BIBLIOGRAFICĂ ASUPRA MICROORGANISMELOR BIODEGRADATE A POLIETILENULUI CU DENSITATE SCĂZUTĂ ȘI EFECTELE LOR PE MATERIAL Nelson Ricardo Acuña Molina LUCRU DE LICENȚĂ PENTRU A OPTA PENTRU GRAU ÎN CHIMIE Directorii: Jorge Alonso Leyiz Rojas Dr.renat García Dr.renat. Codirector: Mario Sánchez Rodríguez dr. UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTATEA DE ȘTIINȚE ȘI EDUCAȚIE CURRICULUM PROIECT DE BACALAUREAT ÎN CHIMIE BOGOTA D.C. 2017 eu

Notă de acceptare Președintele juriului Juriul juriului Bogotá D.C. (01, martie, 2017) II

Dedicare Mamei mele și tuturor profesorilor care mi-au încurajat și sporit curiozitatea și dragostea pentru știință, precum și celor care m-au îndrumat și m-au ajutat să-mi dobândesc cunoștințele și abilitățile științifice. III

Mulțumiri Îi mulțumesc mamei mele pentru sprijinul constant, profesorilor mei pentru toate învățăturile lor, în special directorilor și codirectorului meu Jorge, Josué și Mario pentru efortul și sprijinul lor, și tuturor prietenilor mei care au contribuit într-un fel cu sfaturile și sugestiile lor. în realizarea acestei lucrări, în special David Leonardo Castilla și Néstor Alexander Zambrano care au contribuit cu amabilitate prin recenziile și sugestiile lor. IV

CUPRINS Pagina Lista tabelelor X Lista figurilor XI Lista figurilor XIII Lista anexelor XIV Abrevieri XV Glosar XVI 1. REZUMAT 1 2. INTRODUCERE 2 3 OBIECTIVE 2 3.1 Obiective generale 2 3.2 Obiective specifice 3 4. CONTEXT ȘI JUSTIFICARE 3 4.1. Definiția problemei 3 4.2. Prezentare istorică 4 4.3 Alternative pentru controlul LDPE 5 4.3.1 Înmormântarea în depozitele de deșeuri de LDPE 5 4.3.2 Incinerarea LDPE 5 4.3.3 Piroliza LDPE 6 4.4. Politici de reciclare 6 4.4.1 Problemă de mediu cauzată de LDPE 7 5 CADRU TEORETIC 7 5.1 Polimeri 8 5.1.1 Materiale plastice 8 5.1.2 Poliolefine 8 5.1.2.1.1 Polietilenă (PE) 8 5.1.2.1.2 Clasificarea PE 8 5.1 .2.1.2.1 Polietilenă de joasă densitate (LDPE) 9 5.1.2.1.2.2 Polietilenă liniară de joasă densitate sau (LLDPE) 9 5.1.2.1.2.3 Polietilenă de înaltă densitate (HDPE) 9 5.1.2.1.2.4 Cauze ale inertității chimice de polietilenă 10 5.2 Biopolimeri înlocuitori pentru LDPE 10 5.2.1 Biopolimeri naturali 10 5.2.2 Biopolimeri sintetici 10 5.2.3 Bioplastice 11 5.2.3.1 Bioplastice complet biodegradabile 11 5.2.3.2 Bioplastice bio-fragmentabile 11 5.3 Bioremediere 11 5.3.1 Biodegradare polietilenă densitate 11 (LDPE) 5.3.1.1 Biodeteriorare 12 5.3.1.2 Asimilare 12 V

5.4.2.6.1 Viabilitatea biofilmului microbian 62 5.4.2.6.2 Teste preliminare de caracterizare 62 5.4.2.6.3 Teste de identificare specifice 62 5.4.2.7 Produse de biodegradare 62 5.5 Metodologie propusă 63 5.5.1 Test de viabilitate microorganisme 64 viabile pe placă diluare 5.5.1.1 Prelevarea și selectarea microorganismelor care degradează LDPE în mediu lichid SM 5.5.1.2 Identificarea preliminară 65 5.5.1.3 Testele preliminare de identificare a ciupercilor 66 5.5.1.4 Testul de biodegradare in vitro 67 5.5.2 Testul de pierdere a masei 67 5.5.3 Identificarea specifică 67 5.5.3.1 Tehnică 69 polimorfisme de lungime a fragmentelor de restricție (RFLP) 5.5.4 Teste instrumentale 69 5.5.4.1 Aplicarea FTIR la studiul biodegradării LDPE 69 5.5.4.1.1 Variante ale tehnicii 69 5.5.4.1.1.1 FT-IR Spectroscopie ATR 69 5.5.4.1.1.2 Reflectanța difuză FT-IR (DRIFT) 70 5.5.4.1.2 Indici de cuantificare a oxidării 70 5.5 .4.1 .2.1 Indicele carbonilic (CI) 70 5.5.4.1.2.2 Indicele vinilic (IV) 70 5.5.4.1.2.3 Procentul (%) de cristalinitate a LDPE 70 5.5.4.2 Cromatografie gazoasă cuplată la spectroscopia de masă 71 GCMS 5.5.4.2 .1 Cuantificare producției de CO 2 71 6 ANALIZĂ 72 7. CONCLUZII 77 8. RECOMANDĂRI 78 9. BIBLIOGRAFIE 79 65 IX

LISTA CIFRELOR Pagina 1 Figura 1 a Polietilenă liniară cu densitate scăzută (LLDPE) 9 Figura 1 b Polietilenă cu densitate mică (LDPE) 9 Figura 1 c Polietilenă cu densitate mare HDPE 9 Figura 2 Factori care afectează biodegradarea LDPE 13 Figura 3 Căi transformarea ipotetică a polietilenei până la mineralizarea totală a acestuia 14 Figura 4. Biodegradarea PE prin β-oxidare 14 Figura 5 Inițiatori ai oxidării PE 15 Figura 6 Mecanismul descompunerii hemolitice sau fotolizei 16 Figura 7 Inițierea de la un agent metalic 16 Figura 8 Propagarea fotooxidării 17 Figura 9 a Mecanisme de oxidare în urma reacțiilor Norrish de tip 1 și 2 17 Figura 9 b Oxidarea pentru formarea acizilor grași sau 17 esteri Figura 10 Tehnici și metode disponibile pentru studiul degradării LDPE 37 Figura 11 Schema metodologică de bază propusă 64 Figura 12 Metode preliminare de identificare metabolică 66 Figura 13 Metodologia care trebuie efectuată pentru identificarea specifică a 68 Figura 14 Procedură pentru izolarea microorganismelor biodegradabile LDPE Figura 15 Procedură pentru cultura, izolarea și identificarea microorganismelor degradante LDPE 100 101 XI

LISTA GRAFICILOR Pagină Grafic 1. A Variația producției mondiale de materiale plastice din 1950 până în 2010 Graficul 1. B Variația producției mondiale de materiale plastice din 1950 până în 2013 Graficul 2. Proporția genurilor raportate care sunt legate de biodegradarea (LDPE) Graficul 3. Tehnici cele mai utilizate pentru a studia biodegradarea LDPE 4 4 75 76 XIII

LISTA ANEXELOR. ANEXA A2. ANEXA B. Izolarea și numărarea microorganismelor biodegradabile LDPE Cultura microorganismelor biodegradabile LDPE Purificarea microorganismelor biodegradabile LDPE 100 101 102 ANEXA C Test de biodegradare LDPE 103 ANEXA D Extracția ADN-ului din ciuperci 104 ANEXA E. Extracția ADN-ului din bacterii 105 ANEXA F. Discriminarea între grupuri microbiene folosind RFLP 106 ANEXA G1. Teste de identificare a bacteriilor 107 ANEXA G2. Teste de identificare a bacteriilor 108 ANEXA G3. Teste de identificare a bacteriilor 109 ANEXA G4. Teste de identificare a bacteriilor 110 ANEXA H Lista substanțelor pentru medii și teste 111 ANEXA I Procedura sugerată pentru însămânțare 114 ANEXA J1 Tabelul caracteristicilor preliminare bacteriene 115 ANEXA J2 Caracteristicile preliminare bacteriene 116 ANEXA J3 Caracteristicile preliminare bacteriene 117 ANEXA K1 Procedura de analiză a polietilenei folosind FTIR ANEXA K2 Procedură pentru analiza polietilenei folosind FTIR ANEXA L1 Cuantificarea producției de CO 2 și identificarea metaboliților ANEXA L2 Cuantificarea producției de CO 2 și identificarea metaboliților 118 119 120 121 XIV

5.1.2.1.2.1 LDPE din polietilenă cu densitate redusă Structura sa este foarte ramificată (în aproximativ 2% din atomii de carbon) [51]. Greutatea sa moleculară este de 100.000-300.000 [g/gmol] și densitatea sa este de 0,90-0,91 [gr/cm 3] fiind densitatea cea mai mică și acest lucru se reflectă în calitățile sale reologice, este utilizat la fabricarea pungilor de unică folosință. 5.1.2.1.2.2 Polietilenă liniară de joasă densitate sau (LLDPE), care este o variantă cu ramificare mică, ar putea fi clasificată ca cristalinitate intermediară, cu o valoare de 0,915 g/cm 3 fiind relativ compactă. 5.1.2.1.2.3 Polietilenă de înaltă densitate (HDPE) Structura sa prezintă cel mai înalt grad de liniaritate, greutatea sa moleculară este de 200.000-400.000, [g/gmol] și densitatea sa este de 0,94-0,97 0,91 -0,94 [gr/cm 3], datorită acestui fapt, este un material foarte rigid și puternic utilizat la fabricarea cutiilor de plastic. a) b) 1000 c) 4000 1000 Figura 1 structuri din polietilenă, a) polietilenă liniară de joasă densitate (LLDPE); b) polietilenă de densitate mică (LDPE); c) polietilenă de înaltă densitate HDPE. 9

gradul de oxidare al materialului și tipul de aditiv adăugat, care poate fi amidon sau pro-oxidanți. Ca urmare a lucrărilor raportate, a fost efectuat un mecanism ipotetic de biodegradare, care este prezentat mai jos. Figura 3 Căi hipotetice de transformare a polietilenei până la mineralizarea totală a acestuia pe baza articolelor din [63, 45, 68]. Figura 4 Biodegradarea PE prin sursa de β-oxidare [65] 14

Autorul este conștient de cât de consumator de timp și de scump poate fi să faci atât de multe teste, atât identificarea preliminară, cât și identificarea specifică ar putea dura luni sau poate ani. Structura metodologică de bază va fi după cum urmează: Figura 11 Schema metodologică de bază propusă 5.5.1 Numărul testului de viabilitate al microorganismelor viabile prin diluarea plăcii Testul de viabilitate sau diluare a plăcii și numărul unităților de formare a coloniei sunt propuse, deoarece este ușor și rapid, de asemenea, permite separarea și individualizarea speciilor de microorganisme hidrocarbonoclaste (cel puțin cele care pot supraviețui in vitro). (A se vedea ANEXA L2) Calcule 1) Numărați numai acele cutii (diluții) care conțin de la 30 la 300 de colonii. 2) Cu următoarea ecuație calculați CFU/g s.s. CFU/g pe. = (NC 1/FD 1/V)/(P FH). Unde: CFU/g pe. = unități care formează colonii/g PE. NC = numărul de colonii dintr-o cutie. FD = factorul de diluare care corespunde diluției din care a fost prelevată proba cu care se inoculează cutia (10-2 până la 10-10). V = volumul inoculat în cutie = 0,1 ml. P = greutatea probei umede = 1 g. FH = factor de corecție a umidității (1 (% umiditate/100)). 64

5.5.1.1 Obținerea unei probe și selectarea microorganismelor degradante LDPE în mediu lichid SM Se propune realizarea unui mediu lichid SM selectiv, deoarece este ideal pentru dezvoltarea microorganismelor biodegradabile LDPE și a fost testat, de asemenea, în studii multiple de biodegradare, care generează fiabilitate. Colectarea probei Prelucrarea probei Adăugarea la mediul de cultură lichid Incubare (a se vedea ANEXA A 2). 5.5.1.2 Identificare preliminară Pentru identificarea genurilor bacteriene, pot fi efectuate următoarele teste biochimice și microbiologice, cum ar fi catalaza, pentru bacterii (a se vedea ANEXA G1). la. Bulion de tioglicolat OF; b. Testul oxidazei c. Testul catalazei d. Testul malonat e. Test citrat j. Test de fermentare, 2,3-butandiol și acid mixt. F. Test hipurat g. Testul Kligler h. Tsi fier trei zaharuri i. Test MR/VP k. Agar de fier lizinic l. Agar fenilalanină deminanază m. Moeller n. Decarboxilarea aminoacizilor 65

Figura 12 Metode preliminare de identificare metabolică 5.5.1.3 Teste preliminare pentru identificarea ciupercilor Pentru ciuperci se vor efectua următoarele teste: Pentru izolarea și numărarea ciupercilor care degradează PE, a fost utilizată aceeași tehnică și mediu ca și pentru bacterii, cu diferența că Rose Bengal și streptomicina sunt adăugate la mediu și pH-ul este ajustat la 4,9 [187]. Pentru a le cultiva, pot fi utilizate sabouraud agar, PDA, bumbac albastru lactofenol (LPCB) și observarea microscopică și macroscopică este utilizată pentru identificarea lor. 66

Alicote ale genei amplificate rezultate din PCR cu acești primeri universali pot fi secvențiate ieftin în laboratoare comerciale sau, în multe cazuri, în laboratoare universitare. Odată ce secvența genei rrna este cunoscută, acestea pot fi utilizate pentru a identifica microorganismele originale la nivel de gen și specie [271]. Secvențele unui număr mare de specii bacteriene au fost computerizate în baze de date [271]. Acest lucru permite compararea unei secvențe rrna necunoscute cu o secvență bacteriană cunoscută [271]. Multe programe de analiză a secvenței sunt disponibile pentru a ajuta la identificarea secvențelor. O astfel de bază de date este BLAST (Instrument de căutare a alinierii locale de bază), care reprezintă instrumentul local de căutare a alinierii de bază, care este furnizat de Centrul Național (NCBI) pentru informații despre biotehnologie care este disponibil pe web [271]. Primeri universali 16S rrna preluați din [271]. 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1492R TACGGY * TACCTTGTTACGACTT * Y poate fi C sau T o poziție de bază degenerată. Figura 13 Metodologia care trebuie utilizată pentru identificarea specifică 68

limitează utilizarea lor [67] fiind necesară o îmbunătățire chiar și în acestea. Când toate aceste bariere vor fi depășite, cu siguranță în curând, problema poate fi definitiv rezolvată sau pot apărea alte probleme noi, doar timpul ne va spune, dar abuzul, iresponsabilitatea și inconștiența acțiunilor noastre ca societate vor fi și trebuie să fie problemele eradica din mintea societății. Adevărul este că, deși sunt cele mai raportate, nu înseamnă că sunt cele mai bune care fac această lucrare, pur și simplu că sunt cele mai omniprezente până în prezent. Fără îndoială, Aspergillus sp. Acestea sunt cele mai omniprezente microorganisme degradante din polietilenă găsite până în prezent, fiind foarte departe de celelalte genuri cu 81 de specii, ceea ce arată că ciupercile sunt foarte versatile și nu necesită mediu, hrană și condiții, pe lângă faptul că sunt foarte populare în rândul cercetătorilor. Graficul 2 numărul de referințe obținute de genul de ciuperci și bacterii care sunt legate de biodegradarea (LDPE). 75

ANEXA A1 Izolarea și numărarea microorganismelor degradante LDPE Figura 14 procedură pentru izolarea microorganismelor biodegradabile LDPE adaptate din [187, 94] Pentru izolarea și numărarea ciupercilor degradante PE, a fost utilizată aceeași tehnică și mediu ca și pentru bacterii. Cu diferența că trandafirul Bengal și streptomicina sunt adăugate la mediu și pH-ul este ajustat la 4,9. 100

ANEXA A2 Izolarea și identificarea microorganismelor degradante LDPE Figura 15 Procedură pentru cultura, izolarea și identificarea microorganismelor degradante LDPE. 101

ANEXA B Purificarea și izolarea microorganismelor degradante LDPE Figura 16 Procedură pentru izolarea microorganismelor degradante LDPE și propagarea lor ulterioară pentru a efectua extracția ADN. Pentru a extrage ADN-ul fungic, nu ar trebui să fie semănat pe agar, deoarece răzuirea lasă urme de mediu care interferează cu extracția ADN-ului. Metoda propusă este cea înregistrată de Rojas Triviño [276] 102

ANEXA C Test de biodegradare LDPE Figura 17 Test de biodegradare in vitro adaptat din [237, 126] 103

ANEXA D Extracția ADN-ului din ciuperci Figura 18 Metoda propusă este cea înregistrată de Mahaku modificată de [203]. 104

ANEXA E Extracția ADN-ului din bacterii Figura 19 Metoda de extragere a ADN-ului este cea înregistrată de Centrul Internațional pentru Agricultura Tropicală-CIAT folosind tampon de extracție (CTAB) Tabelul 16 a cerut reactivilor cu concentrațiile lor respective, preluați din [276] Cantitatea de concentrație a reactivului NaCl 5M 14mL EDTA ph 8,0 0,5M 2,0 ml Tris-HCl ph8,0 1M 5mL SDS - 0,5g Apă sterilă distilată Se completează până la 50mL Reactiv Concentrație Cantitate NaCl 1,4M 8,18mL EDTA ph 8,0 20mM 4, 0 ml Tris-HCl ph8,0 100mM 10mL CTAB 2% 2g PVP 40 1% 1g Figura 20 Cuantificarea ADN-ului microbian 105

ANEXA F PCR Discriminarea între grupurile microbiene utilizând Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Figura 21 Propunere metodologică pentru realizarea tehnicii RFLP luată și adaptată din [277]. 106

ANEXA G1 Teste de identificare a bacteriilor Figura 22 Identificare bacteriană utilizând testul LAR pe agar, Kligler, tioglicolat și triptofan. 107

ANEXA G2. Teste de identificare a bacteriilor Figura 23 teste de identificare microbiană, pulbere de amidon, TCI, catalază oxidază 108

ANEXA G3 Teste de identificare a bacteriilor Figura 24 Teste de decarboxilare a lizinei ornitinei, fenilalanină deaminază 109

ANEXA G4 Figura 25 RMN VP, OF și teste de fermentare a glucozei 110