STUDIUL TOXICITĂȚII COMBINATE ALE MODELELOR DE AFLATOXINA B1 ȘI OCRATOXINEI A IN IN VITRO ȘI ÎN VIVO TOXICITATE COMBINATĂ A MODELELOR DE AFLATOXIN B1 ȘI OCHRATOXIN A IN IN VITRO ȘI ÎN MODURILE VIVO Laura Ana Corcuera Martínez TEZĂ DE DOCTORAT

combinată

Lucrarea de cercetare intitulată: STUDIUL TOXICITĂȚII COMBINATE A AFLATOXINEI B1 ȘI OCRATOXINEI A IN MODELURI IN VITRO ȘI IN VIVO TOXICITATE COMBINATĂ A AFLATOXINEI B1 ȘI OCHRATOXIN A IN MODELURI VITRO ȘI IN VIVO prezentate de doamna Laura Ana Corcuera Martínez pentru doctorand aspirant Universitatea din Navarra, a fost desfășurată în cadrul Departamentului de Științe Alimentare, Fiziologie și Toxicologie sub conducerea Dr. Adela López de Cerain Salsamendi și co-direcția Dr. Elena González-Peñas Pamplona, ​​aprilie 2012 Dra. Adela López de Cerain Salsamendi Dra. Elena González-Peñas

Această lucrare a fost finanțată prin proiectele: Micotoxine: toxicitatea tratamentului combinat al ochratoxinei A și aflatoxinei B1 în modele in vitro și in vivo Ministerul Științei și Inovării al Guvernului Spaniei Referință: AGL2008-01437/ALI Prezența toxinelor în hrana și implicarea sa în sănătatea umană Fundația CAN Referință: 10829

Pentru familia mea din Pamplona, ​​Begoña, Miguel, Lander, Javier, Jose, Asier, Txikitin, María, Manolo. pentru că m-a primit cu atâta afecțiune și m-a făcut să mă simt ca acasă. Lui Iban, pentru că a făcut fiecare pas cu mine pe această cale, pentru că mă ridic când cad și pentru răbdarea ta. Îți mulțumesc că mă iubești atât de mult și mă înțelegi atât de bine. Această teză este și a ta, iar viitorul este al nostru. Pentru familia mea, pentru că țin la mine. Ama, Bunica și Bunicul care au văzut începutul și din cer văd sfârșitul. Al Yayo, care se poate bucura de acest triumf cu mine. Pentru unchii mei Ignacio și Begoña, pentru María. Fratele meu Luis, vă mulțumesc pentru încurajare, curiozitate și admirație, mă faceți să vreau să fiu mai bună în fiecare zi. Nimic nu ar fi fost posibil fără părinții mei, stâlpii vieții mele. Vă mulțumesc că m-ați învățat că munca bine făcută este succesul în sine. Mulțumesc pentru dragostea ta, pentru că ai crezut în mine și mi-ai spus că aș putea. Acesta este și premiul tău. MULȚUMIRI TUTUROR! 9

Părinții mei A Iban Au primit-o pentru că nu știau că este imposibil Jean Cocteau

Abrevieri/Abrevieri ABREVIERI/ABREVIERI 3-ADON: 3-acetildeoxinivalenol/3-acetildeoxinivalenol 8-oxo-dG: 8-oxoguanină/8-oxoguanină 15-ADON: 15-acetildeoxinivalenol/15-acetildeoxinivalenol/Afen1Ben1 AFB1-formamidopirimidină/AFB1-formamidopirimidină AFB2: Aflatoxină B2/Aflatoxină B2 AFBO: AFB1-exo-8,9-epoxid/AFB1-exo-8,9-epoxid AFG1: Aflatoxină G1/Aflatoxină G1 AFG2: Aflatoxin G1 AFG2 G2 AEFI: Asociația spaniolă a produselor farmaceutice din industrie AOAC: Asociația Internațională a Chimiștilor Analitici/Asociația Chimiștilor Analitici Oficiali Sit AP: sit apirimidinic sau apurinic AU: Unități arbitrare greutate corporală: greutate corporală CIT: Citrinina/Citrinin CV: Coeficient de variație DCFH - DA: Dihidrodiclorofluoresceină diacetat/Dihidrodiclorofluoresceină diacetat DL 50: Doză letală 50 DON: Deoxinivalenol/Deoxinivalenol DTI: Aport zilnic tolerabil CE: Comisia Europeană/Comisia Europeană EFSA: Autoritatea Europeană de Siguranță Alimentaria/Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară 13

Abrevieri/Abrevieri OECD: Organizație pentru Cooperare și Dezvoltare Economică/Organizație pentru Cooperare și Dezvoltare Economică OTA: Ocratoxină A/Ocratoxină A PBS: tampon fosfat/tampon fosfat pc salină: greutate corporală PECE: extract de cacao îmbogățit cu polifenol/polifenol -extract de cacao îmbogățit pk a: constantă de disociere a acidului RE: eroare relativă SCF: Comitetul științific pentru alimentația Comisiei Europene/Comitetul științific pentru alimente SCOOP: Cooperarea științifică în problemele alimentare/Cooperarea științifică în problemele legate de alimente) RF: fluorescența relativă ROS: Specii de oxigen reactiv/Specii de oxigen reactiv RSD: Abatere standard/Abatere standard relativă SE: Eroare standard t 1/2: Timp de înjumătățire plasmatică eliminat/Timp de înjumătățire plasmatică T-2: Toxină T-2/T-2 toxină TWI: Consum săptămânal tolerabil UA: Unități arbitrare UHPLC-LD: Ultra cromatografie re lichidă foarte ridicată soluție cu detector de ultraviolete/detector de cromatografie lichidă ultra-performantă - detector de fluorescență UV: detector de ultraviolete OMS: Organizația Mondială a Sănătății/Organizația Mondială a Sănătății ZEA: Zearalenonă/Zearalenonă

CUPRINS/CUPRINS Capitolul 1/Capitolul 1 Introducere generală/generală Introducere 17 Capitolul 2 Scop, obiective și schiță 55 Capitolul 3 Ocratoxina A reduce deteriorarea ADN indusă de aflatoxina B1 detectată prin testul cometei în celulele Hep G2 61 Capitolul 4 Un extract de cacao îmbogățit cu polifenol reduce radicalii liberi produși de micotoxine 85 Capitolul 5 Validarea unei metode analitice UHPLC-FLD pentru cuantificarea simultană a aflatoxinei B1 și ochratoxinei A în plasma de șobolan, ficat și rinichi 109 Capitolul 6 O abordare a toxicității și toxicocineticii aflatoxinei B1 și ochratoxinei A după administrarea orală simultană la șobolani F344 135 Capitolul 7 Ocratoxina A reduce genotoxicitatea aflatoxinei B1: Aplicarea simultană a micronucleului in vivo și analiza cometei 159 Capitolul 8 Discuție generală 187 Capitolul 9/Capitolul 9 Concluzii/Concluzii 207 17

Capitolul 1/Capitolul 1 Introducere generală/Introducere generală

Capitolul 1/Capitolul 1 AFLATOXINA B1 Proprietăți chimice AFB1 aparține familiei cumarinei difuranice. Nomenclatura sa sistematică este 2,3,6aα, 9aα-tetrahidro-4-metoxiciclopenta [c] -b-furo [2 ', 3': 4,5] furo [2,3-h] cromene-1,11-dione, C 17H 12O 6 este formula sa moleculară și greutatea sa este de 312,27 g/mol. Variații ușoare ale structurii sale chimice dau naștere la setul de aflatoxine care pot fi găsite în natură (AFB1, AFB2, AFG1 și AFG2). AFB1 este cel cu cea mai mare concentrație, urmat de AFG1, AFB2 și AFG2. Ordinea pe care o urmează aceste substanțe în ceea ce privește toxicitatea acută și cronică este AFB1> AFG1> AFB2> AFG2 și este direct legată de capacitatea de a forma un epoxid la dubla legătură 8-9 (marcată cu o săgeată roșie în figură) și potența asociată cu ciclopentenone inele (săgeată albastră) (McLean și Dutton, 1995). Aflatoxinele M1 și M2 sunt produșii de hidroxilare ai metabolismului oxidativ al aflatoxinelor B1 și, respectiv, B2. Figura 1: Aflatoxine prezente în natură (EFSA, 2007) 24

Introducere generală/Introducere generală care induce formarea de 8-OHdG în ficatul de șobolan și rață. Această deteriorare a ADN-ului poate induce transversia G> T, ceea ce ar duce la o contribuție la carcinogenitatea AFB1 (Bedard și Massey, 2006). Figura 4: Evoluția aductului ADB-AFB1 (Smela și colab., 2002) 31

Capitolul 1/Capitolul 1 că OTA în forma sa fenolică (OTA -) este transformată într-un cation fenoxoniu (figura 8, J) care la rândul său se transformă în OTAQ (figura 8, K) (Ringot și colab., 2006; Dai și colab. al., 2002). Pe de altă parte, administrarea repetată de OTA este capabilă să reducă semnificativ nivelurile de antioxidanți intracelulari precum glutation (GSH), superoxid dismutază (SOD), catalază (CAT) sau glutation peroxidază (GSPx) în ficat și rinichi (Meki și Hussein, 2001) și crește peroxidarea lipidelor (Khan și colab., 1989). Studiile de structură-activitate au postulat că atomul de clor este esențial pentru efectul genotoxic al OTA, deoarece compușii clorurați care induc deteriorarea ADN-ului, suferă un proces de bioactivare la benzoquinone în prealabil (Ringot și colab., 2006). Figura 8: Formarea ROS de către OTA (Ringot și colab., 2006) Studiile privind expresia genelor au arătat că OTA este capabilă să reducă expresia genelor implicate în protecția oxidativă intracelulară mai intens în ficat decât în ​​rinichi (Cavin și colab., 2007; Arbillaga și colab., 2008); și care crește expresia oxidului de azot sintetază 40

Introducere generală/Introducere generală inductibilă (inos), enzimă responsabilă de producerea de oxid nitric (NO). NO poate reacționa cu O 2- și poate genera peroxinitrite care evoluează în specii reactive de azot (RNS) care reacționează cu ADN și proteine ​​(Marin Kuan și colab., 2011). Informațiile disponibile sugerează că este puțin probabil ca OTA să acționeze printr-un singur mecanism de acțiune. OTA, în special în rinichi, generează stres oxidativ direct (generarea de radicali care modifică ciclurile redox) și indirect (scăderea apărării antioxidante). Ambele mecanisme pot interacționa, deoarece reducerea apărării amplifică impactul producției de radicali liberi (Marin Kuan și colab., 2011). Prin urmare, mecanismul de acțiune propus ca responsabil pentru carcinogenitatea OTA ar fi o rețea de interacțiune a mecanismelor epigenetice, inclusiv inhibarea sintezei proteinelor, stresul oxidativ și activarea anumitor căi de semnalizare celulară (Marin Kuan și colab., 2008 ). 41

Straturile din capitolul 1/capitolul 1, cantități mai mici de AFB1 și OTA au fost observate la sân, ficat și rinichi, precum și la ouă depuse (Zahoor Ul Hassan și colab., 2011). Datele existente arată că studii adecvate pentru a stabili antagonisme, sinergii și efecte aditive sunt rare și dificil de interpretat. Ca punct de plecare, se poate face o încercare de a înțelege toxicitatea combinată a micotoxinelor pe baza mecanismului lor individual de acțiune în celulă. Astfel, în micotoxinele cu moduri de acțiune similare s-ar putea aștepta efecte aditive sau chiar unele interacțiuni ar putea fi antagoniste (Speijers, 2004). În cazul AFB1 și OTA, mecanismele de acțiune sunt foarte diferite, dar ambele încep în biotransformarea în citocromul P450, deci ar putea apărea orice tip de asociere. În practică, rezultatul cantitativ sau calitativ obținut poate fi foarte diferit de cel așteptat și, după cum a fost revizuit, AFB1 și OTA pot da orice tip de interacțiune între ele in vitro și in vivo. Rezultatul pare să depindă de specie sau de studiul de toxicitate efectuat sau chiar de tipul de punct final utilizat. 44

Capitolul 1/Capitolul 1 OMS, 2001. Evaluarea siguranței anumitor micotoxine din alimente. OMS Additive Food Series 47. Wild, C. și Gong, Y., 2010. Micotoxinele și bolile umane: o problemă de sănătate globală ignorată în mare măsură. Carcinogeneză 31, 71-82. Williams, J.H., Phillips, T.D., Jolly, P.E., Stiles, J.K., Jolly, C.M. și Aggarwal, D., 2004. Aflatoxicoza umană în țările în curs de dezvoltare: o analiză a toxicologiei, expunerii, consecințele potențiale asupra sănătății și intervențiile. Am J Clin Nutr 80, 1106-1122. Wong, Z.A. și Hsieh, D.P.H., 1980. Metabolismul comparativ și toxicocinetica aflatoxinei B1 la maimuță, șobolan și șoarece. Toxicol Appl Pharmacol 55, 115-125. Xiao, H., Madhyastha, S., Marquardt, R.R., Li, S., Vodela, J.K., Frohlich, A.A. și Kemppainen, B.W., 1996. Toxicitatea ocratoxinei A, forma sa deschisă de lactonă și mai mulți dintre analogii săi: relații de activitate a structurii. Toxicol Appl Pharmacol 137, 182-192. Zahoor Ul Hassan, M.Z., Khan, A., Khan, I., Javed, Z. și Hussain, 2011. Efectele administrării individuale și combinate de ochratoxină A și aflatoxină B (1) în țesuturi și ouă ale găinilor de reproducție White Leghorn. J Sci Food Agric doi: 10.1002/jsfa.4740. Zeljezic, D., Domijan, A.M. și Peraica, M., 2006. Deteriorarea ADN-ului de către ochratoxina A în rinichi de șobolan evaluată prin testul cometei alcaline. Braz J Med Biol Res 39, 1563 54

Scop, obiective și schiță Capitolul 2

Scop, obiective și schiță Capitolul 8: Cele mai importante constatări ale capitolelor anterioare sunt discutate în această secțiune. Capitolul 9: Sunt prezentate principalele concluzii ale proiectului de cercetare. 59

Capitolul 3 Ocratoxina A reduce afectarea ADN indusă de aflatoxina B1 detectată prin testul cometei în celulele Hep G2 Laura-Ana Corcuera., Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Amaia Azqueta, Adela López de Cerain Toxicologia alimentară și chimică 49 (2011) 2883 2889

Capitolul 3 Rezumat Micotoxinele aflatoxina B1 (AFB1) și ochratoxina A (OTA) pot fi prezente împreună în produsele alimentare. Acești contaminanți alimentari sunt considerați a fi genotoxine, acționând prin diferite mecanisme. Scopul acestei lucrări a fost de a caracteriza efectele combinate genotoxice in vitro ale ambelor micotoxine din celulele Hep G2. În acest scop, citotoxicitatea a fost determinată mai întâi în tratamente izolate și combinate pentru a determina gama de doze din studiile de genotoxicitate. Co-expunerea celulelor la AFB1 + OTA timp de 24 de ore a dus la efecte aditive. Genotoxicitatea a fost determinată în celulele Hep G2 prin testul cometei modificat cu enzime de restricție (endo III și FPG). Formarea semnificativă a speciilor reactive de oxigen a fost detectată atât în ​​tratamentele unice, cât și în cele combinate. AFB1 a fost genotoxic după 3 ore cu activare metabolică externă (amestec S9) și după 24 ore fără activare metabolică. Co-expunerea la OTA a scăzut semnificativ daunele ADN induse de AFB1, nu numai în pauze și în siturile apurinice, ci și în siturile sensibile la FPG. Contradicția aparentă dintre efectele citotoxice aditive și efectele antagonice genotoxice poate fi explicată dacă AFB1 și OTA concurează pentru aceleași CYP, producând mai mulți ROS, dar mai puțini aducti AFB1. 64

OTA reduce genotoxicitatea AFB1 in vitro Tabelul 1: valorile IC 50 în linia celulară Hep G2 după 24 ore de tratament unic sau combinat. IC50 µm HepG-2 AFB1 100 OTA 360 OTA + 100 µm AFB1 100 OTA + 150 µm AFB1 200 Figura 1: Curbele de viabilitate ale Hep G2 după 24 ore de incubare cu OTA și AFB1 singur și în combinație, obținute cu testul MTT. Pentru a observa efectul semnificativ al micotoxinelor împreună, fiecare combinație a fost comparată cu tratamentul unic cu OTA (p 0,05) sau 100 și 150 µm de AFB1 (fără semnificație). Se arată media și SD a trei experimente. Genotoxicitate La 3 ore fără amestec de șobolani S9, AFB1 nu a indus rupturi de catenă de ADN sau situsuri AP (figura 2A) și nu s-au găsit daune semnificative după tratamentul cu enzime (figura 2B). În schimb, când s-a utilizat activarea metabolică, o relație semnificativă doză-răspuns a fost evidentă în pauzele directe ale ADN-ului începând de la 30 µm (figura 2C). Mai mult, o creștere semnificativă a deteriorării ADN-ului a fost detectată de FPG la aceeași concentrație (figura 2D). După 24 de ore de tratament cu AFB1, s-a observat un efect de răspuns la doză cu rupturi semnificative ale firelor induse de ADN (figura 2E). În plus, la 6 µm, s-a arătat o inducție semnificativă clară a siturilor FPG care nu a apărut la 3 ore (figura 2F). Nr. 71

OTA reduce AFB1 genotoxicitatea in vitro . Deteriorarea ADN-ului a fost măsurată în unități arbitrare (0-400). Se rupe catenele ADN și siturile AP sunt reprezentate grafic în A, C și E. Daunele oxidative detectate prin post-digestie cu enzimele sunt reprezentate ca site-uri net endo III (portocaliu) și situri sensibile la FPG net (galben) în B, D și F. Pentru a observa efectele semnificative ale tratamentelor, fiecare concentrație a fost comparată cu celulele netratate (C-) (* p 0,05). Se arată media și SD a trei experimente. 73

Capitolul 3 Figura 3: Ploturi comparative de deteriorare a ADN-ului după expunerea celulelor Hep G2 la AFB1 și AFB1 + 50 µm OTA timp de 24 de ore măsurate cu testul cometei. Deteriorarea ADN-ului a fost măsurată în unități arbitrare (0-400). Deteriorarea ADN-ului a fost măsurată ca rupturi de catenă de ADN și situsuri AP (A) sau daune oxidative, exprimate ca site-uri sensibile endo III (B) sau FPG (C). Pentru a observa diferențe semnificative între tratamente, combinațiile AFB1 + OTA au fost comparate cu expuneri unice la AFB1 (* p 0,05). Se arată media și SD a trei experimente. Figura 4: ROS intracelular al celulelor Hep G2 tratate cu AFB1 (A în albastru), OTA (B) și amestecuri de AFB1 + 50 µm OTA (A în albastru deschis) timp de 24 de ore. Nivelurile ROS au fost exprimate ca fluorescență per procent de supraviețuire. Rezultatele au fost comparate cu controlul lor negativ (* p 0,05). Se arată media și SD a patru experimente. 74

OTA reduce genotoxicitatea AFB1 in vitro 1082-1090. Turesky, R.J., 2005. Perspectivă: ochratoxina A nu este un cancerigen genotoxic. Chem Res Toxicol 18, Uhl, M., Helma, C. și Knasmuller, S., 1999. Analize de electroforeză cu gel unicelular cu celule de hepatom derivate de la om (Hep G2). Mutat Res 441, 215-224. Urrego Novoa, J.R. și Diaz, G.J., 2006. Aflatoxinele și mecanismele sale de toxicitate în cancerul hepatic. Rev Fac Med Una 54, 108-116. Wang, H. și Joseph, J.A., 1999. Cuantificarea stresului oxidativ celular prin testarea cu diclorofluoresceină utilizând cititorul de microplăci. Radic liber Biol Med 27, 612-616. 83

Capitolul 4 Un extract de cacao îmbogățit cu polifenoli reduce radicalii liberi produși de micotoxine Laura-Ana Corcuera, Susana Amézqueta, Leire Arbillaga, Ariane Vettorazzi, Sonia Touriño, Jusep Lluis Torres, Adela López de Cerain Toxicologie alimentară și chimică 50 (2012) 989-995

PECE reduce radicalii liberi in vitro menținuți la -20 ° C până la utilizare. Soluțiile PECE și AFB1 au fost păstrate în întuneric pentru a evita degradarea luminii. Experimentele au fost efectuate fără ser de vițel fetal (FCS) pentru a evita interacțiunile serice cu legarea PECE sau micotoxinele de proteine. Analiza statistică Au fost efectuate trei experimente independente pentru a verifica citotoxicitatea și inducerea ROS. Datele sunt prezentate prin analiza descriptivă [medie ± deviație standard (SD) a experimentelor replicate]. Comparațiile au fost efectuate prin testul ne-parametric Kruskal-Wallis H și testul U Mann-Whitney. P 0,05 a fost acceptat ca nivel de semnificație. Rezultate Prepararea PECE și compoziția medie de polifenoli A apă: acetonă 3: 7 extract de cacao conținând monomeri și oligomeri C și EC a fost preparat așa cum s-a descris anterior. Curbele de calibrare ale C, EC, Cya-Cat și Cya-EC au fost pregătite acoperind domeniul de lucru. Au fost analizate șase standarde din fiecare compus și s-a obținut un răspuns liniar versus concentrație. Analizele probelor au fost efectuate în triplu exemplar având un RSD