rezumat

OBIECTIV: Să investigheze efectele inhibitoare ale CT-II, extractul Nomame Herba, asupra activității lipazei in vitro și asupra obezității la șobolanii hrăniți in vivo cu o dietă bogată în grăsimi .

PROIECTARE: Testul efectului inhibitor al CT-II asupra activității lipazei a fost realizat prin măsurarea acizilor grași liberi eliberați după incubarea mediului cu CT-II, lipaza pancreatică porcină și trioleina (experimentul 1). În experimentele in vivo, șobolanii slabi sau obezi (570-718 g) au fost hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi conținând 60% grăsimi cu sau fără CT-II timp de 8 săptămâni (experimentul 2), timp de 14 zile (experimentul 3) sau timp de 12 săptămâni (experimentul 4), respectiv.

MĂSURARE: evoluția în timp a greutății corporale, aportul alimentar, greutatea organelor (grăsime parametrială, ficat, inimă și rinichi) și parametrii plasmatici (trigliceride, colesterol total, glucoză, AST, ALT și insulină), producția de fecale grăsimi totale și colesterol total măsurat. Au fost efectuate și examene histologice hepatice.

Rezultate: CT-II a inhibat activitatea lipazei porcine într-o manieră dependentă de doză in vitro (experimentul 1). Greutatea corpului și a ficatului au fost reduse, iar examenul histologic al ficatului a arătat o îmbunătățire a ficatului gras la animalele tratate cu CT II (experimentul 2). CT-II a inhibat în mod semnificativ creșterea în greutate corporală și creșterea trigliceridelor plasmatice într-o manieră dependentă de doză, fără a afecta aportul de alimente la șobolanii slabi care au primit o dietă bogată în grăsimi. AST și ALT plasmatice crescute au scăzut, de asemenea (experimentul 3). Când șobolanii obezi care au alimentat o dietă bogată în grăsimi au fost tratați cu CT-II timp de până la 6 luni, greutatea corporală a fost inițial redusă și ulterior creșterea în greutate a fost eliminată semnificativ. Grăsimea totală corporală a fost, de asemenea, semnificativ redusă și s-a observat o reducere semnificativă a AST și ALT plasmatice (experimentul 4).

CONCLUZII: Aceste rezultate au demonstrat că inhibitorul lipazei CT-II este eficient în prevenirea și ameliorarea obezității, a ficatului gras și a hipertrigliceridemiei la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi.

Acces furnizat de

Introducere

Lipaza pancreatică este cea mai importantă enzimă pentru digestia trigliceridelor din dietă. 1 Aplicarea unui inhibitor de lipază a fost discutată anterior ca tratament pentru obezitate. Orlistat (Ro 18-0647), un derivat lipstatinic hidrogenat derivat din Streptomyces toxitricini, este un inhibitor puternic al lipazei gastrice, pancreatice și carboxilester 2 și s-a dovedit a fi eficient pentru tratamentul obezității umane. 3, 4, 5 Existența inhibitorilor de lipază a fost investigată în diferite produse alimentare, iar prezența acestor inhibitori a fost raportată în cereale, în tărâțe de grâu și germeni de grâu 6 și în soia 7, 8. Inhibitorii lipazei au fost căutați și în produsele naturale, cum ar fi medicamentele chinezești și diferite plante medicinale. 9

O plantă de leguminoase, Cassia mimosoides L. var. nomame Makino (Nomame Herba), este cultivat în Japonia și China și este consumat în mod tradițional ca ceai în Japonia. În cursul selectării inhibitorilor lipazei dintre produsele naturale, un extract de Nomame Herba a arătat un efect inhibitor remarcabil asupra lipazei. În prezentul studiu, au fost examinate efectul inhibitor al acestui extract, CT-II, asupra activității lipazei in vitro și efectele antiobezității la șobolanii hrăniți in vivo cu o dietă bogată în grăsimi. .

Metode

Pregătirea CT-II

CT-II a fost o fracțiune din extractul etanol apos de la Nomame Herba, conținând în principal proantocianidină (tanin condensat). Prepararea fracției a fost după cum urmează: 800 g din partea aeriană a plantei uscate au fost extrase cu 10 l etanol 50% (4 l, 3 l, 3 l, trei extracții). Extractul a fost supus unei coloane Diaion HP 20 (Mitsubishi Chemical Corporation), spălat cu 30% etanol și eluat cu 80% etanol. Soluția eluată a fost evaporată și liofilizată la sec, apoi s-au achiziționat 24 g de pulbere CT-II. Pulberea CT-II a fost utilizată ca amestec cu dieta experimentală in vivo. .

Efect inhibitor in vitro al CT-II asupra activității lipazei

Testul activității lipazei utilizând trigliceride ca substrat a fost efectuat conform metodei lui Fukumoto și colab. 10 În rezumat, efectul inhibitor al (pH 7, 4) și 1 ml soluție CT-II 50% tetrahidrofuran (THF) au fost amestecate într-o eprubetă de tip L (~ 18 × 120 mm) și 1 ml soluție porcină pancreatică lipaza (Sigma tip II, 0,71 mg/ml ca proteină în tampon McIlvaine) a fost apoi adăugată și incubată la 37 ° C timp de 15 minute cu agitare. Reacția a fost oprită prin adăugarea de etanol și acizii grași eliberați au fost titrați cu 0,05 M. NaOH. Semifabricatul a fost măsurat folosind 50% THF fără CT-II (experimentul 1).

Efectele in vivo ale CT-II asupra greutății corporale, a grăsimii corporale și a metaboliților

Animale și dietă.

Femele de șobolan Sprague-Dawley au fost utilizate în studiu. Au fost adăpostite în cuști individuale din oțel inoxidabil la o temperatură controlată (24 ± 2 ° C) și pe un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore, cu acces gratuit la apă și o dietă bogată în grăsimi sub formă de pulbere conținând 60% grăsimi, 7,5% glucide 24,5% Proteine ​​(6,7 kcal/g) ca în studiul anterior. 11 Dieta normală care conține în principal făină de soia degresată și făină de pește se numește dietă extrudată (CE-2, Clea Japan Inc.).

Proceduri.

CT-II a arătat inițial activitate inhibitoare a lipazei în studiul in vitro. Deoarece aportul excesiv de grăsimi alimentare contribuie la dezvoltarea obezității, efectele preventive ale extractului asupra dezvoltării obezității au fost examinate la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. După adaptarea la dieta bogată în grăsimi și condițiile de laborator timp de 1 săptămână, șobolanii slabi cu greutatea de 239-251 g au fost împărțiți în două grupe. Grupul de control a primit doar o dietă bogată în grăsimi; Celălalt grup a primit o dietă bogată în grăsimi cu CT-II amestecat într-o concentrație de 2,5%. Greutatea corporală este măsurată în fiecare săptămână. După 8 săptămâni de tratament cu CT-II, animalele au fost sacrificate, greutatea organelor au fost măsurate și organele au fost examinate histologic (experimentul 2).

Au fost apoi examinate efectele dozei de CT-II asupra greutății corporale și a metaboliților plasmatici la șobolani. Șobolanii slabi cu o greutate de 265–298 g au fost împărțiți în șase grupe. Grupul de control a primit doar dieta bogată în grăsimi ca în experimentul 2. Celelalte cinci grupuri au primit dieta bogată în grăsimi cu CT-II amestecat în concentrații de 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,5% și respectiv 3,5%. Greutatea corporală a fost măsurată la 4, 7, 11 și 14 zile după începerea tratamentului CT-II, iar aportul zilnic de alimente a fost măsurat în perioada de tratament de 2 săptămâni. Ulterior, sângele a fost extras din vena jugulară după un post de 12 ore. Probele au fost centrifugate și plasma a fost separată și congelată până la testare. Trigliceridele plasmatice (TG), colesterolul total (TC), glucoza, aspartat aminotransferaza (AST, EC 2.6.1.1) și alanina aminotransferaza (ALT, EC 2.6.1.2) au fost măsurate folosind procedurile descrise mai jos în „Analize” (experiment 3) .

În cele din urmă, s-a evaluat dacă CT-II poate reduce sau nu obezitatea la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Șobolanii la care obezitatea fusese indusă de dieta bogată în grăsimi, cântărind 570-718 g, au fost împărțiți în două grupuri. Grupul de control (greutatea corporală medie, 643 g) a continuat să primească doar această dietă. Al doilea grup (greutatea corporală medie, 641 g) a primit dieta bogată în grăsimi cu CT-II amestecat într-o concentrație de 2,0%. Greutatea corporală a fost măsurată săptămânal. După 4 săptămâni de tratament, consumul de alimente, producția totală de grăsimi fecale și colesterolul total din fecale au fost măsurate timp de 3 zile. După 12 săptămâni de tratament, sângele a fost extras din inimă după 12 ore de post și plasma a fost separată și înghețată până la test (TG, TC, glucoză, AST, ALT și insulină; experimentul 4).

eseuri

Glucoza a fost analizată prin metoda glucozei oxidazei. Colesterolul total (TC), trigliceridele (TG), aspartat aminotransferaza (AST) și alanina aminotransferaza (ALT) au fost analizate de un autoanalizor chimic uscat (AU-5200, OLYMPUS). Insulina a fost determinată prin test imunologic. 12 Greutățile organelor (grăsime parametrică, ficat, inimă și rinichi) au fost măsurate și înregistrate ca procent din greutatea corporală finală împreună cu valorile absolute. Grăsimea totală a carcasei a fost determinată prin extragerea omogenatului liofilizat din carcasă fără piele. Carcasa a fost jupuită, iar grăsimea subcutanată care adera la piele a fost răzuită cu un cuțit ascuțit sau o spatulă. Carcasa fără piele și grăsimea subcutanată au fost combinate și omogenizate prin trecerea de două ori printr-o mașină de tocat carne (Meat Mincer β10, BONNY Inc.) cu o placă de plasă de 3,2 mm și apoi liofilizată. Extracția lipidică a omogenatului liofilizat al carcasei fără piele a fost efectuată prin metoda Folch 13 și extractele au fost evaporate in vacuo și cântărite. Conținutul total de grăsime a fost calculat ca valoare absolută și procentul din greutatea corporală finală.

Analiza statistică.

Datele au fost exprimate ca media ± și analizate prin testul Student și Aspin-Welch ANOVA sau măsuri repetate ANOVA unidirecționale, după caz; O valoare de p

inhibitorului

Efectul CT-II asupra activității lipazei. Activitatea lipazei a fost măsurată folosind lipaza pancreatică porcină și trioleina ca substrat. Efectul inhibitor s-a arătat ca scăderea activității relative (%) față de activitatea lipazică a martorului (0 mg/ml CT-II).

Imagine la dimensiune completă

Figura 2 arată rata creșterii în greutate corporală a șobolanilor slabi hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi cu sau fără CT-II (experimentul 2). Câștigul celor hrăniți cu dietă care conține 2,5% CT-II a fost suprimat semnificativ de la 1 la 8 săptămâni în timpul tratamentului (P

Efectul CT-II asupra creșterii în greutate corporală la șobolanii slabi hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Valorile sunt media ± se (%) (n = 6). Modificările creșterii în greutate corporală în fiecare perioadă de tratament sunt prezentate ca procent din greutatea corporală inițială. (•) Control; (▴) CT-II 2, 5% în dietă. *** Indicați diferențe semnificative în testul t Student și Aspin-Welch care compară 2,5% din grupul CT-II cu grupul de control (0% din CT-II) (* P

Comparația histologiei ficatului la șobolanii slabi alimentați cu o dietă bogată în grăsimi după 8 săptămâni de tratament CT-II. Multe picături de grăsime care prezintă sfere albe mari în controalele netratate au fost îndepărtate sau reduse în dimensiune.

Imagine la dimensiune completă

Efectele dependente de doză ale creșterii în greutate corporală a șobolanilor hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi cu și fără CT-II sunt prezentate în Tabelul 2. CT-II a suprimat creșterea în greutate corporală în mod dependent de doză. Ratele de creștere în greutate a celor patru grupuri care au alimentat dieta care conțin 1,0-3,5% CT-II au fost suprimate semnificativ (P

Efectul CT-II asupra creșterii în greutate corporală la șobolanii obezi hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Valorile sunt media ± se (%) (n = 6). Modificările creșterii în greutate corporală în fiecare perioadă de tratament sunt prezentate ca procent din greutatea corporală inițială. (•) Control; (▴) CT-II 2,0% în dietă. *** Indicați diferențele semnificative în testul t Student și Aspin-Welch care compară 2,0% din grupul CT-II cu grupul de control (0% din CT-II) (* P 2.14 și s-a dovedit că are anti -activitate obeză și antihipercolesterolemică la diferite modele animale, 15, 16 și la om. lipaza într-un sistem de testare a lipazei

În experimentul 2, administrarea CT-II a inhibat creșterea în greutate corporală la șobolanii slabi alimentați cu o dietă bogată în grăsimi într-o manieră dependentă de doză. Această inhibiție nu a depins de scăderea consumului de alimente, deoarece nu a existat nicio diferență în cantitatea de alimente consumate între șobolanii tratați cu CT-II și care nu au fost tratați cu CT-II. TG plasmatic a fost, de asemenea, redus în funcție de doză. AST și ALT au fost reduse după 2 săptămâni de tratament cu CT-II, iar histologia ficatului după 2 luni de tratament a arătat o îmbunătățire a ficatului gras. Rezultatele au arătat, de asemenea, că tratamentul CT-II a prevenit ficatul gras.

Testul de echilibru între grăsimea administrată și grăsimea excretată în scaun după 4 săptămâni de tratament a arătat o creștere a acesteia din urmă, sugerând inhibarea lipazei intragastrointestinale de către CT-II, care ar fi rezultat din suprimarea hidrolizei și absorbției de trigliceride, așa cum se arată in vitro în prezentul studiu. Prin urmare, inhibarea activității lipazei pancreatice a fost, de asemenea, demonstrată in vivo. A crescut și excreția colesterolului în fecale. THL inhibă activitatea colesterolesterazei și lipazei. Prin urmare, există posibilitatea ca inhibarea colesterolului II-colesterol de către CT-II să fie suprimată de inhibarea colesterolului. Cu toate acestea, CT-II nu a scăzut colesterolul plasmatic, deși a crescut excreția colesterolului în scaun, așa că sunt necesare mai multe cercetări pentru a înțelege această observație.

Un efect advers al inhibitorului de lipază THL este apariția foarte frecventă a diareei la om. 3, 5 Cu toate acestea, șobolanii tratați cu CT-II în prezentul studiu nu au prezentat diaree sau chimie anormală a sângelui, sugerând că extractul are mai puține efecte adverse decât THL.

Pe scurt, inhibitorul lipazei CT-II a fost eficient în prevenirea și ameliorarea obezității, a ficatului gras și a hipertrigliceridemiei la șobolanii hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi. Rezultatele sugerează că CT-II poate fi o substanță utilă pentru a preveni și trata obezitatea și hipertrigliceridemia la oameni.