EVALUAREA ACTIVITĂȚII COMPONENTELOR ESENȚIALE DE ULEI ALE PLANTELOR COLOMBIANE ÎMPOTRIVA Trypanosoma cruzi ȘI Leishmania spp LAURA VIVIANA HERRERA SANDOVAL UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER FACULTATEA DE SĂNĂTATE MASTER ÎN ȘTIINȚE DE BAZĂ BIOMEDICAS 2011 1

evaluarea

EVALUAREA ACTIVITĂȚII COMPONENTELOR ESENȚIALE DE ULEI ALE PLANTELOR COLOMBIANE ÎMPOTRIVA Trypanosoma cruzi ȘI Leishmania spp LAURA VIVIANA HERRERA SANDOVAL Lucrare de licență prezentată ca o cerință pentru a se califica pentru titlul de: MASTER ÎN ȘTIINȚE BIOMEDICE DE BAZĂ Director PATRICIA ESCOBAR, Mc. D. UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER FACULTATEA DE SĂNĂTATE MASTER ÎN ȘTIINȚE BIOMEDICE DE BAZĂ BUCARAMANGA 2011 2

DEDICARE Dacă urechea ta înclină spre înțelepciune și inima ta se predă inteligenței; dacă chemați informații și cereți discernământ; Dacă îl căutați ca argintul, ca o comoară ascunsă, atunci veți înțelege frica de Domnul și veți găsi cunoașterea lui Dumnezeu. Pentru că Domnul dă înțelepciune; cunoștințele și cunoștințele curg din buzele sale Proverbe 2: 2-6 către Dumnezeu, care poate face totul. 6

Mulțumiri Tutorului meu, dr. Patricia Escobar pentru colaborarea sa imensă, îndrumarea, sprijinul și mai ales răbdarea de-a lungul procesului meu de formare și dezvoltare a acestei lucrări. Dr. Elena Stashenko și grupul ei de lucru CENIVAM: Camilo, Deyanira și William pentru informații și asistență tehnică oferite. CĂLĂ COLCIENCIAS pentru finanțarea acestei lucrări prin Centrul de Cercetare de Excelență CENIVAM (CO nr. 432-Colciencias). Colegilor din laboratorul de chimioterapie, în special Sandra Leal pentru sprijinul său tehnic și științific. Pentru toți oamenii: familia, prietenii, colegii și profesorii care într-un fel sau altul au contribuit la executarea acestei lucrări. 7

CUPRINS Pagina INTRODUCERE. 17 1. DECLARAȚIA PROBLEMEI. 20 2 JUSTIFICARE. 22 3 ÎNTREBARE DE CERCETARE. 24 4. CADRUL TEORETIC. 25 4.1 Boala Chagas. 25 4.1.1 Generalități. 25 4.1.2 Parazitul 27 4.1.3 Tratament. 27 4.2 LEISHMANIASIS. 30 4.2.1 Generalități. 30 4.2.2 Parazitul. 32 4.2.3 Tratament. 33 4.3 ULEIURI ESENȚIALE ȘI COMPONENTELE LOR. 38 4.3.1 Generalități. 38 4.3.2 Compoziția chimică. 38 4.3.3 Activitatea biologică. 42 5. STADIUL ART. 44 6. OBIECTIVE. 47 6.1 Obiectiv general. 47 6.2 Obiective specifice. 47 7. METODOLOGIE. 48 10

7.1 Proiectare metodologică. 48 7.2 Uleiuri esențiale (EA). 48 7.2.1 Colecție, caracterizare și compoziție. 48 7.2.2 Selectarea AE. 49 7.3 Componentele principale ale EA utilizate. 55 7.4 Medicamente de referință. 59 7.5 Pregătirea stocului și a soluțiilor de lucru. 59 7.6 Paraziți și celule de mamifere. 59 7.7 Test de toxicitate asupra celulelor la mamifere. 60 7.8 Teste de activitate în T. cruzi. 60 7.8.1 Activitate în forme extracelulare. 60 7.8.2 Activitate în amastigote intracelulare. 61 7.9 Încercări de activitate în Leishmania. 61 7.9.1 Activitate în forme extracelulare. 61 7.9.2 Activitate în amastigote intracelulare. 61 7.10 Analiza rezultatelor. 62 8. REZULTATE. 72 8.1 Rezultate în selectarea componentelor și EA. 72 8.2 Activitatea componentelor din celulele mamiferelor. 74 8.3 Activitate în T. cruzi. 76 8.3.1 Activitatea componentelor. 76 8.3.2 Activitatea componentelor față de Nifurtimox. 76 8.3.3 Activitatea componentelor din celulele T. cruzi versus Vero. 77 8.4 Activitate în Leishmania. 79 11

8.4.1 Activitatea componentelor. 79 8.4.2 Activitatea medicamentului de referință. 79 8.4.3 Relația activității Leishmania față de celulele THP-1. 80 8.5 Comparația activității componente la T. cruzi și L. chagasi. 83 8.6 Relația activității componentei față de EA care o conține: indicele de activitate (IA). 83 8.7 Analiza chimio-computerică a componentelor active. 89 9. DISCUȚIE. 91 10. CONCLUZII. 98 11. BIBLIOGRAFIE. 101 12

LISTA CIFRELOR Pagina Figura 1. Formele parazitare ale genului Trypanosoma 28 Figura 2. Ciclul de viață al Trypanosoma Cruzi 30 Figura 3. Ciclul de viață al genului Leishmania 35 Figura 4. Exemple de structuri chimice ale componentelor aromatice ale uleiurilor esențiale 40 Figura 5. Exemple de structuri chimice ale terpenelor AE 41 Figura 6: Exemple de structuri chimice ale sesquiterpenelor AE 41 Figura 7. Proiectare metodologică aplicată în prima fază a studiului 50 Figura 8. Proiectare metodologică aplicată în a doua fază a studiului 51 Figura 9. Cantitatea relativă de componente selectate ale uleiurilor esențiale din genul Lippia 73 Figura 10. Cantitatea relativă de componente selectate ale uleiurilor esențiale din genul Piper 74 13

LISTA TABELELOR Pagina Tabelul 1. Clasificarea taxonomică a genului Leishmania 34 Tabelul 2. Studiile activității AE și componentele sale principale față de speciile Leishmania și T. cruzi 46 Tabelul 3. Numărul AE în funcție de activitatea lor antiparazitară 49 Tabelul 4. Familii AE cele mai frecvente active la T. cruzi și L. chagasi 52 Tabelul 5. Genuri active de uleiuri esențiale la T. cruzi și L. chagasi 52 Tabelul 6. Identificarea AE a plantelor aromatice selectate în studiu și active la T. cruzi și L chagasi 54 Tabelul 7. Caracteristicile chimice ale componentelor uleiurilor esențiale active selectate 56 Tabelul 8. Criteriile de clasificare a activității in vitro a compușilor 63 Tabelul 9. Compoziția chimică a AE din genul Lippia 64 Tabelul 10. Compoziția chimică a AE a Genul Tagetes 66 Tabelul 11. Compoziția chimică a AE a genului Piper 68 Tabelul 12. Activitatea componentelor în celulele de mamifere 75 Tabelul 13. Activitatea componentelor în T. Cruzi 78 14

Tabelul 14. Activitatea componentelor din L. chagasi 81 Tabelul 15. Activitatea componentelor din L. Panamensis 82 Tabelul 16. Indicii de activitate ai Apinene 85 Tabelul 17. Indicii de activitate ai Carvacrol 86 Tabelul 18. Indicii de activitate ai timolului 87 Tabelul 19. Indicii de activitate a Trans-β-cariofilenei 88 Tabelul 20. Predicția riscului de toxicitate a componentelor studiate 90 Tabelul 21. Analiza activității biologice a componentelor uleiurilor esențiale evaluate în prezentul studiu 100 15

LISTA ABREVIERILOR AE Uleiuri esențiale AmB Amfotericină B CC 50 Concentrație citotoxică 50 CC 90 Concentrație citototoxică 90 CI 50 Concentrație inhibitoare 50 CI 90 Concentrație inhibitoare 90 CENIVAM Centrul Național de Cercetare pentru agroindustrializarea speciilor de plante aromatice medicinale tropicale DE Deviație standard DMSO Dimetilsulfoxid IA Indice de activitate IS Indice de selectivitate LC Leishmanioză cutanată LV Leishmanioză viscerală MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2-difeniltetrazolium bromură) NC Nu se calculează ND Nu se determină NFX Nifurtimox NT PBS netoxic PBS fosfat soluție salină tampon PMA Phorbol acetat de miristat 16

activitate la paraziți. Pentru a compara activitatea componentei cu cea a EA care o conține, a fost calculat Indicele de activitate (AI), definit ca raportul dintre activitatea EA la paraziți și activitatea componentei în celule. Componentele au fost clasificate în funcție de criteriile de activitate și s-au efectuat teste statistice pentru a stabili diferențele semnificative în activitatea lor cu privire la: tipul de compuși, tipul de paraziți și modul de viață (liber sau intracelular), tipul de celule și medicamentul de referință valorile p