epiderma

  • Subiecte
  • rezumat
  • Introducere
  • Rezultate
  • Impactul inactivării suprabazale a factorului AP1 asupra morfologiei epidermice
  • Expresia suprabazală a TAM67 crește proliferarea keratinocitelor din stratul bazal
  • Expresia suprabazală a TAM67 blochează formarea tumorii
  • TAM67 versus TPA: un fenotip similar
  • Discuţie
  • Factorii AP1: un rol cheie în epiderma normală
  • Impactul inactivării suprabazale a activității factorului AP1
  • Materiale și metode
  • Șoareci transgenici TAM67
  • Studii de cancerigenitate
  • Anticorpi și metode imunologice.
  • Glosar

Subiecte

  • Cancer
  • Proliferarea celulelor
  • Oncogeneza

rezumat

Introducere

Am emis ipoteza că factorii AP1 îndeplinesc funcții diferite în epiderma bazală (proliferativă) versus suprabazală (diferențiată) (Eckert și colab., 2004). Cu toate acestea, testarea acestei ipoteze este complicată de faptul că practic toți membrii familiei AP1 sunt exprimați, la un anumit nivel, în compartimentele bazale și suprabazale (Welter și Eckert, 1995; Angel și colab., 2001; Mehic și colab. ., 2005). Într-un efort de a înțelege rolul factorilor AP1 în carcinogeneza epidermică, Colburn și colegii săi au folosit promotorul K14 pentru a direcționa expresia TAM67 către stratul bazal al keratinocitelor (Young și colab., 1999). TAM67 este o formă dominantă negativă de c-jun care interacționează extensiv cu toți factorii AP1 pentru a inhiba transactivarea (Brown și colab., 1994). În aceste studii interesante, inactivarea factorului de strat bazal AP1 nu a produs modificări evidente în proliferarea keratinocitelor sau în aspectul epidermic sau dermic; cu toate acestea, șoarecii au fost mai puțin sensibili la progresia cancerului (Young și colab., 1999; Thompson și colab., 2002; Cooper și colab., 2003).

Un obiectiv important al prezentului studiu a fost de a evalua rolul factorilor AP1 în epiderma suprabazală. Pentru a realiza acest lucru, am generat șoareci în care TAM67 este exprimat în straturile epidermice suprabazale. Folosim un sistem inductibil care permite activarea reversibilă a expresiei TAM67 în epiderma suprabazală prin administrarea doxiciclinei (Dox) în apa potabilă. Experimentele noastre indică faptul că expresia suprabazală a TAM67 produce o epidermă parakeratotică îngroșată, hiperproliferativă, dar că, în ciuda acestei hiperproliferări extinse, epiderma este rezistentă la formarea tumorilor dependente de DMBA/TPA.

Rezultate

Impactul inactivării suprabazale a factorului AP1 asupra morfologiei epidermice

Imagine la dimensiune completă

Expresia suprabazală a TAM67 crește proliferarea keratinocitelor din stratul bazal

Creșterea grosimii epidermice s-ar putea datora unei supraviețuiri mai mari a celulelor din straturile suprabazale, unei aderențe mai mari a celulelor din straturile stratificate sau unei proliferări mai mari a celulelor bazale. Am testat mai întâi dacă inactivarea suprabazală a factorului AP1 influențează proliferarea keratinocitelor bazale. Pentru a testa acest lucru, monitorizăm încorporarea BrdU și nivelul Ki67. Șoarecii care exprimă TAM67 au fost tratați cu BrdU timp de 2 ore și au fost pregătite secțiuni de țesut pentru detectarea BrdU și Ki67. Așa cum se arată în Figura 2a, numărul de nuclee pozitive BrdU și Ki67 este de cinci ori mai mare în epiderma pozitivă TAM67 (+ Dox), sugerând că proliferarea crescută a stratului bazal și suprabazal contribuie la fenotip.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a evalua în continuare impactul expresiei suprabazale a TAM67 asupra proliferării și diferențierii celulare, am monitorizat expresia markerilor de diferențiere epidermică. Keratina K1, involucrina, filaggrina și loricrina sunt de obicei exprimate în keratinocite suprabazale diferențiate (Eckert și colab., 1997). În epiderma TAM67 pozitivă, K1, involucrina și filaggrina prezintă o expresie normală suprabazală, sugerând că keratinocitele continuă să fie supuse diferențierii (Figura 2b). Cu toate acestea, loricrina, care este prezentă în mod normal ca o bandă discretă în epiderma superioară, este detectată difuz în mai multe straturi suprabazale în epiderma TAM67 pozitivă (Figura 2b). Mai mult, absența funcției suprabazale a factorului AP1 este asociată cu niveluri reduse de involucrin și loricrin (Figura 2c); sugerând că funcția suprabazală a factorului AP1 este necesară pentru a menține expresia acestor gene.

Keratinele K5 și K14 sunt exprimate în mod tipic în keratinocite bazale; cu toate acestea, la șoarecii TAM67 pozitivi, expresia este observată atât în ​​straturile bazale, cât și în cele suprabazale. Prezența acestor proteine ​​în epiderma suprabazală este în concordanță cu ideea că celulele sunt întârziate în diferențiere. Mai mult, am detectat o expresie la nivel înalt a keratinei K6, o keratină care nu este prezentă în epiderma normală, dar este detectată în epiderma hiperproliferativă (Sun și colab., 1983).

Expresia suprabazală a TAM67 blochează formarea tumorii

Formarea tumorii care exprimă TAM67 în epiderma suprabazală. ( la ) Reducerea formării tumorii la șoareci care exprimă TAM67 suprabazal. Șoarecii TAM67-rTA au fost tratați cu sau fără o singură aplicare topică de 100 pg de DMBA urmată o săptămână mai târziu de tratament cu sau fără Dox și TPA timp de 22 de săptămâni, așa cum este descris în Materiale și metode. Șoarecii au fost observați săptămânal pentru debutul tumorii, numărul și dimensiunea. Fiecare grup de tratament a inclus zece animale. Valorile sunt media ± sem. La 10-21 săptămâni, au existat semnificativ mai multe tumori în grupul DMBA + TPA comparativ cu grupul DMBA + TPA (+ Dox), P 2)/2. Sunt prezentate doar grupurile tratate cu DMBA/TPA (± Dox). Fiecare grup de tratament include zece animale și valorile sunt medii ± sem Dimensiunea tumorii la 13-18 săptămâni a fost semnificativ mai mare în grupul DMBA/TPA comparativ cu grupul DMBA + TPA (+ Dox), P

Răspuns la tratamentul acut al TPA. ( la ) Epiderma suprabazală TAM67 pozitivă seamănă cu pielea tratată cu TPA. Șoarecii TAM67-rTA au fost păstrați în apă potabilă cu sau fără Dox timp de 12 zile, urmată de aplicarea topică a TPA așa cum este indicat. După 24 de ore de tratament TPA, țesutul a fost recoltat și secționat pentru colorare H&E sau incubare cu anticorpul indicat. Imaginile fluorescente sunt secțiuni optice confocale de 1 μm. ( b ) Tratamentul acut cu TPA crește proliferarea în epiderma TAM67 pozitivă. Șoarecii TAM67-rTA au fost ținuți pe Dox pe dietă timp de 12 zile. Epiderma a fost apoi expusă cu 10 μg de TPA/100 μl de acetonă și țesutul a fost recoltat 24 de ore mai târziu pentru a fi colorat cu Ki67.

Imagine la dimensiune completă

Apoi examinăm dacă hiperproliferarea observată în epidermă este detectată și în cornee. Așa cum se arată în Figura 5a, TAM67-FLAG este exprimat la niveluri comparabile atât în ​​epidermă, cât și în epiteliul corneei. Cu toate acestea, spre deosebire de epidermă, expresia TAM67 în epiteliul corneei nu provoacă hiperproliferare (Figura 5b), sugerând că hiperproliferarea dependentă de TAM67 este observată doar în epitelii selectați.

Lipsa răspunsului în epiteliul cornean. ( la, b ) Expresie la nivel înalt a TAM67-FLAG în epiteliul cornean al șoarecelui. Șoarecii TAM67-rTA au fost tratați cu sau fără Dox timp de 12 zile și epiteliul epidermic și cornean au fost recoltați pentru a analiza nivelul TAM67-FLAG și pentru a pregăti secțiuni histologice. Rezultatele imunoblotului sunt normalizate pe baza detectării β-actinei (nereprezentată).

Imagine la dimensiune completă

Discuţie

Factorii AP1: un rol cheie în epiderma normală

Rețeaua factorului de transcripție AP1 include membri jun (c-jun, junB, junD) și fos (c-fos, FosB, Fra-1, Fra-2). Ei formează homodimeri și heterodimeri jun-jun și jun-fos care interacționează cu site-urile de legare a ADN-ului consens pe genele țintă pentru a regla expresia genelor. Factorii AP1 sunt integratori cheie ai transducției semnalului în epidermă care mediază intrarea citokinelor, a factorilor de creștere, a agenților de diferențiere și a promotorilor de creștere. Aceste semnale curg prin cascada protein kinazei activată cu mitogen, ducând la funcționarea afectată a factorului AP1. Factorii AP1 controlează proliferarea keratinocitelor (Takahashi și colab., 2002; Shi și Isseroff, 2005; Mizuno și colab., 2006), diferențierea (Eckert și colab., 2003, 2004; Adhikary și colab., 2004) și apoptoza (Efimova și colab., 2004; Raj și colab., 2006) și sunt importante în progresia tumorii și dezvoltarea psoriazisului (Kahn și colab., 1993; Saez și colab., 1995; Rutberg și colab., 2000; Eckert și colab. al., 2002, 2003, 2004; Efimova și colab., 2002, 2003, 2004; Ea și colab., 2002; Iizuka și colab., 2004).

Impactul inactivării suprabazale a activității factorului AP1

În studiul de față examinăm impactul inactivării suprabazale a factorului AP1 asupra diferențierii și proliferării keratinocitelor. Am ales ca model, indicând expresia dominant-negativă c-jun (TAM67) către epiderma suprabazală. Această abordare are mai multe avantaje. În primul rând, TAM67 interferează cu funcția tuturor factorilor de transcripție AP1 (Brown și colab., 1994). În al doilea rând, utilizarea promotorului involucrin permite ca TAM67 să fie direcționat către epiderma suprabazală și ameliorează problemele observate la șoarecii knockout, unde proteina este pierdută din toate straturile. În al treilea rând, există deja un model care vizează stratul bazal TAM67 (Young și colab., 1999, 2002; Thompson și colab., 2002; Cooper și colab., 2003; Matthews și colab., 2007) care permite o comparație a impactului de inactivare bazală versus suprabazală a factorului AP1.

În concordanță cu diferențierea întârziată, cheratinele K5 și K14, care sunt în mod normal exprimate exclusiv în stratul bazal, sunt detectate în toate straturile epidermice. Acest lucru sugerează că evenimentele necesare pentru inactivarea expresiei K5 și K14 sunt compromise. Mai mult, K6 este exprimat în toate straturile epidermice. K6 este o keratină care este exprimată în condiții hiperproliferative, dar nu este exprimată în epiderma normală. K6 este exprimat în psoriazis, epidermă tratată cu ester de forbol și alte afecțiuni asociate cu hiperproliferarea keratinocitelor (Sun și colab., 1984; Heyden și colab., 1994a, 1994b; Iizuka și colab., 2004). Astfel, expresia suprabazală a TAM67 duce la proliferarea crescută a stratului bazal și diferențierea întârziată și, în cele din urmă, duce la hiperkeratoză extinsă.

Datorită fenotipului hiperproliferativ, anticipăm că șoarecii suprabazali TAM67 ar fi susceptibili la formarea tumorii. Nu s-au format tumori la șoareci TAM67 pozitivi sau negativi tratați cu DMBA; cu toate acestea, tratamentul cu DMBA/TPA a dus la formarea tumorii. A fost o surpriză să constatăm că formarea tumorală dependentă de DMBA/TPA a fost redusă semnificativ la șoarecii suprabazali TAM67. Acest lucru sugerează că, deși TAM67 duce la creșterea proliferării epidermice, acest lucru nu se traduce prin creșterea formării tumorale. Considerăm posibilitatea ca TAM67 să interfereze cu activitatea de promovare a proliferării TPA în protocolul de carcinogeneză. Cu toate acestea, experimentele noastre sugerează că epiderma care exprimă TAM67 este pe deplin competentă să răspundă la TPA. Epiderma TAM67 pozitivă are de cinci ori mai multe celule bazale pozitive Ki67, iar majoritatea celulelor suprabazale sunt, de asemenea, pozitive.

Aceste studii indică faptul că TAM67 are un impact clar asupra funcției epidermice. Cu toate acestea, este interesant faptul că expresia TAM67 nu afectează epiteliul corneei (Figura 5). Această constatare sugerează că nu toate țesuturile pot răspunde la întreruperea funcției AP1. Nu este clar de ce epiteliul corneean ar fi rezistent la interferența TAM67 cu funcția factorului AP1, dar este interesant faptul că epiteliul cornean este foarte rezistent la cancer (Cutler, 2004).

Materiale și metode

Șoareci transgenici TAM67

Studii de cancerigenitate

Anticorpi și metode imunologice.