rezumat

Acest protocol oferă o metodă de încredere pentru a stabili șoareci umanizați cu sistemul imunitar uman și celulele hepatice. Șoarecii imunodeficienți dubli reconstituiți obținuți prin injectarea intrasplenică de hepatocite umane și celule stem hematopoietice CD34 + sunt susceptibile la infecția cu virusul 1 a imunodeficienței umane și la recapitularea leziunilor hepatice observate la pacienții infectați cu HIV.

Abstract

Introducere

De la apariția terapiei antiretrovirale, a existat o scădere substanțială a deceselor legate de monoinfecția cu HIV-1. Cu toate acestea, boala hepatică a apărut ca o cauză comună de morbiditate la pacienții infectați cu HIV 1, 2. Co-infecțiile cu virusul hepatitei cu infecția cu HIV-1 sunt mai frecvente, reprezentând între 10% și 30% dintre persoanele infectate cu HIV din Statele Unite 3, 4, 5 .

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Acest protocol a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) de la Centrul Medical al Universității din Nebraska.

NOTĂ: Obțineți aprobarea IACUC locală înainte de a efectua experimente pe animale.

1. Prelucrarea sângelui din cordonul ombilical și izolarea shumano HSpC

2. Pregătirea hepatocitelor umane pentru transplant

  1. Îndepărtați hepatocitele crioconservate din azot lichid, scufundați rapid flaconul în baia de apă și dezghețați aproximativ 90 - 120 s.
  2. Îndepărtați capacul din flacon și turnați hepatocitele dezghețate în tubul conic de 50 ml al mediului de dezgheț încălzit.
  3. Suspendați celulele legând manual tubul de 50 ml timp de câteva secunde.
    NOTĂ: Nu rotiți tubul.
  4. Respingeți celulele la 100 x g timp de 8 minute la temperatura camerei. Se spală celulele peletate în PBS cu 0,1% BSA și se agită cu HSCC proaspăt sau dezghețat (raport 10: 1) în PBS într-un volum final de 80 μl/șoarece.

3. Managementul animalelor, screening-ul, genotiparea și tratamentul pentru hSPC uman și transplant de hepatocite

4. Validarea grefei hepatice umane de către ELISA și a sistemului imunitar uman prin citometrie în flux

NOTĂ: Evaluați reconstituirea ficatului uman și a sistemului imunitar lunar, începând cu o lună după transplant prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA) și, respectiv, citometrie în flux.

5. Infecția cu HIV a șoarecilor TK-NOG și efectul acesteia asupra ficatului și sistemului imunitar uman

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

dublu

figura 1 : Schema de îmbogățire a celulelor CD34 + din sângele din cordonul ombilical. (LA) Sângele din cordonul ombilical este stratificat în mediu de separare a limfocitelor (LSM) și centrifugat pentru a izola stratul tampon. (B) Coloanele LS sunt așezate pe un suport magnetic și clătite cu tampon BSA, urmate de adăugarea unui strat tampon. Celulele pozitive pentru CD34 sunt prinse în coloane, iar celulele CD34 sunt eluate în tuburi separate. Celulele CD34 + prinse în rășini de coloană sunt cufundate, iar celulele sunt colectate într-un tub nou. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.


Figura 4 : Concentrația de albumină este măsurată prin ELISA în serul șoarecilor umani duali. Șoarecii sunt transplantați cu hepatocite umane (HEPs) și CD34 + celule stem/progenitoare hematopoietice (HSPC) (# 11). Serul este colectat în momente diferite la 1, 4 și 6 luni după transplant, iar diluțiile se fac pentru a se adapta la concentrațiile de probe necunoscute în gama standardelor. Fiecare simbol reprezintă o valoare individuală a mouse-ului. Rezultatele reprezintă mediana, precum și valorile individuale. * P 8. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.


Figura 5: Efectul asupra HIV-1 în nivelurile serice de albumină și epuizarea hepatocitelor umane CK18 + în ficatul șoarecilor umani duali. (LA) Concentrațiile de albumină sunt monitorizate la șoareci neinfectați (# 9) transplantați cu HEP și HSpC uman la 1 și 4 luni. Șoarecii sunt infectați (n x 10) cu HIV la 4-5 luni după transplant și sacrificați la 5 săptămâni după infecție. Fiecare simbol reprezintă o valoare individuală a mouse-ului. Rezultatele reprezintă mediana, precum și valorile individuale. * P 8. (B) Secțiuni hepatice de cinci microni de la șoareci TK-NOG neinfectați (HEPs + HSP, panoul din stânga) și șoareci TK-NOG infectați cu HIV (HEPs + HSCCP + HIV, panoul din dreapta) sunt fixate, încorporate în parafină și colorate pentru anti-umane anticorpi împotriva citokeratinei-18 (CK18). HIV-1 care determină epuizarea hepatocitelor CK18 + este evidențiat de o zonă mai puțin ocupată de celulele umane CK18 +. Rezultatele prezentate aici provin de la un șoarece neinfectat și un șoarece infectat cu HIV transplantat cu două hepatocite umane și HSPC.


Figura 6 : Raportul dintre celulele CD4 + și CD8 + T în sângele periferic și ficatul șoarecilor duali reconstituiți, care nu sunt infectați și infectați cu HIV-1. Pentru șoareci neinfectați reconstituiți dublu: cerc închis; HEPs + HSPC; sânge # 7; ficat # 6. Pentru șoareci infectați cu HIV-1: cercuri deschise; HEPs + HSPCs + HIV; sânge n la 10; ficatul # 11. Rezultatele reprezintă valori mediane, precum și valori individuale. * P 8. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

În prezent, umanizarea dublă este demonstrată prin transplantul de CD34 + HSCCP uman și celule hepatice fetale; Cu toate acestea, manipularea animalelor nou-născute creează probleme tehnice 13, 14. HSCCP pot fi derivate sau izolate din mai multe surse, cum ar fi celulele hepatice fetale (FLC), celulele stem embrionare (ESC) și CB. Cu toate acestea, problemele etice limitează utilizarea ESC și FLC. CB nu are o astfel de restricție și este o alternativă mai utilă pentru obținerea HSCCP, precum și o sursă prețioasă de celule stem hematopoietice primitive și progenitoare care pot reconstitui sistemul imunitar funcțional. Sângele din cordonul ombilical nu trebuie să fie mai vechi de o zi când este utilizat pentru izolarea HSCCP, deoarece performanța HSCCP este foarte afectată de vârstă. Puritatea HSCCP-urilor izolate trebuie verificată înainte de celule de crioconservare. Contaminarea încrucișată a limfocitelor T CD3 + este evitată, deoarece poate duce la boala sistemică de grefă a șoarecilor și la aleajecția acută a HPH în timpul transplantului cu celule nepotrivite.

Hepatocitele disponibile comercial au fost utilizate ca sursă pentru reconstituirea ficatului 8, 13. Hepatocitele adulte sunt preferate pentru stabilirea reconstituirii ficatului datorită eficienței lor mai mari în altoire și durabilitate pe o perioadă lungă de timp 29.

Prezența sistemului imunitar uman într-un model de șoarece a crescut nivelul ALB, așa cum s-a demonstrat anterior 30, 31. Cu toate acestea, eficiența hepatocitelor și reconstituirea sistemului imunitar pot varia în funcție de diferite surse de celule donatoare și pot depinde de șoarecele receptor. Prin urmare, fiecare șoarece trebuie evaluat pentru greutate, iar partea cea mai critică este utilizarea anticorpilor sau reactivilor specifici omului și care nu reacționează încrucișat cu celulele șoarecilor. Reactivii și anticorpii specifici omului utilizați în studiul prezentat aici sunt detaliați în Tabelul materialelor. Dacă alți anticorpi decât cei specificați în Tabelul materialelor pentru studiu, asigurați-vă că verificați specificitatea umană.

Condiția optimă ar fi transplantul de celule simgenice; cu toate acestea, acest lucru este dificil de realizat din punct de vedere tehnic. Ori de câte ori este posibil, HSCCP-urile și hepatocitele ar trebui să fie combinate de la donatori cu antigene clasa 1 de leucocite umane parțial împerecheate (cum ar fi HLA-A2).

Pentru a examina șoarecii pentru studiile HIV, sângele este extras în mai multe momente de timp pentru a determina reconstituirea optimă a ficatului și a imunității; Citometria de flux și ELISA sunt preferate deoarece pot fi efectuate doar cu o cantitate mică de sânge. Celulele sanguine și serul din aceeași probă ar putea fi utilizate pentru citometrie în flux și, respectiv, ELISA. Este important să se efectueze diluții serice adecvate la fiecare moment (interval 1.000 - 40.000) pentru a evalua nivelurile de ALB, astfel încât concentrațiile necunoscute să poată fi aduse în intervalul de concentrații standard (gama kit: 6,25 - 400 ng/mL).

Citokinele pro-inflamatorii ca răspuns la infecția cu HIV-1 în prezența sistemului imunitar uman pot fi, de asemenea, utile în abordarea interacțiunii hepatocitelor și a celulelor imune. Modelul este util pentru a arăta imunopatogeneza bolii hepatice induse de HIV-1, deoarece recapitulează leziunile hepatice în același mod ca la om, evidențiată de un raport scăzut CD4: CD8, o scădere a nivelurilor de ALB, decesul de către hepatocitele Activarea ficatului imun. Modelul are, de asemenea, unele limitări, cum ar fi un nivel scăzut de activitate a celulelor T citotoxice și modificarea modificării clasei de imunoglobulină. Datorită prezenței atât a sistemului imunitar uman, cât și a ficatului, modelul prezentat aici arată promisiuni pentru coinfecțiile virusului HIV-1 și hepatitei, infecției cronice cu hepatită (pentru a clarifica mecanismele răspunsului imun împotriva hepatitei) și ca ciroză. Model.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.