Sursa: Consiliul pentru Dezvoltare Științifică, Umanistică și Tehnologică a Universității Centroccidentale "Lisandro Alvarado" (UCLA, Venezuela)

starea

Beneficiar: Aura América Lуpez-Ortega, Ysabel Cristina Mбrquez-Alvarado, Aleidy Josefina Aranguren-Parra, Miguel Бngel Plaza- Carriуn și Marнa Divina Murillo Lуpez de Silanes

Cuvinte cheie: ficat gras, etionină, stres oxidativ, disfuncție.

Rezumat: În medicina veterinară, rolul stresului oxidativ (OS) în producția și reproducerea animalelor a devenit important datorită alterării ambelor funcții la animalele cu hepatosteatoză sau ficat gras (FL). Acest studiu a urmărit să determine dacă s-a stabilit o stare de SO hepatică în FL experimental cauzată de etionină la șoareci masculi adulți RMN și dacă funcția hepatică a fost modificată. Au fost utilizate două grupuri de 10 animale: unul martor și altul tratat cu DL-etionină intraperitoneal la 7,5 mg/20 g greutate corporală. Amploarea și caracteristicile FL au fost determinate histologic și cantitatea de depozit de grăsime hepatică a fost stabilită prin concentrația de trigliceride. Ambele analize au confirmat generarea de hepatosteatoză la bărbații injectați cu DL-etionină. Produsele provenite din degradarea lipoperoxidativă (diene conjugate (CD) și malondialdehidă (MDA), indicatori ai OS celular, au fost cuantificate spectrofotometric prin concentrația sa în omogenat hepatic. Deteriorarea funcției hepatice a fost măsurată prin niveluri plasmatice de alanină aminotransferază (ALT) și aspartat aminotransferază ( AST), folosind kituri comerciale. Inducerea FL a determinat o creștere semnificativă a CD de la 231,18 ± 15,53 µmol/mg proteină la 297,45 ± 23,10 mmol/mg proteină (P

Cuvinte cheie: ficat gras, etionină, stres oxidativ, disfuncție.

Stresul oxidativ (OE) este implicat în procesele inflamatorii, precum și în afecțiunile hepatice, se raportează concentrații mari de specii reactive de O2 (ROS) [18], iar originea afectării ficatului a fost legată de existența radicalilor liberi (RL) care poate lipoperoxidarea componentelor celulare, cum ar fi membranele, și poate provoca modificări care duc la pierderea funcției celulare. În NAFLD, funcția hepatică este afectată așa cum a fost determinat experimental [13]. Prezentul studiu a urmărit să determine dacă în HG experimental cauzat de etionină la șoareci albini de laborator (Mus musculus Linnaeus, 1758) RMN mascul mascul adult, s-a stabilit un statut EO în ficat, precum și să cuantifice posibila modificare a funcției a spus organul.

MATERIALE ȘI METODE

Pentru acest studiu, s-au utilizat șoareci masculi din populația șoarecilor albini de laborator, în special din tulpina NMRI, de la Centrul pentru animale al Universității Centroccidentale Lisandro Alvarado (UCLA), Venezuela. Prin eșantionare simplă aleatorie, 20 de șoareci masculi adulți cu o greutate corporală medie de 27,5 ± 1,5 grame (g) au fost selectați pe o scară animală Ohaus (Tripe Bean Balance, seria 700, Florham Park, NJ, SUA). cuști, în cicluri de lumină de 12 ore (h) de lumină/12 ore de întuneric în condițiile standardizate ale Bioteriumului Unității de cercetare în științe funcționale "Dr Haity Moussatchй" (UNIHM) Decanul de Științe UCLA Medicină Veterinară (DCV). Cu acces gratuit la apă și o hrană comercială pentru șoareci Ratarina® (Protinal, Venezuela). Studiul a fost realizat în conformitate cu Codul de bioetică și biosecuritate al FONACIT-Venezuela [10].

Inducerea HG nealcoolic:

Animalele au fost distribuite aleatoriu în două grupuri de câte 10 animale: un grup de control și altul injectat cu DL-etionină (Sigma Chemical Co., MO, SUA) dizolvate în soluție fiziologică sterilă, administrată i.p. în doze de 7,5 mg/20 g greutate corporală. Controalele au fost injectate doar cu vehiculul (soluție fiziologică sterilă). Ambele grupuri au fost supuse unui post de 48 de ore, cu acces gratuit la apă potabilă.

Eșantionare, determinări:

După 48 de ore de post, șoarecii, prin venipunctură coccigiană, au obținut o probă de sânge tratată cu acid etilendiamină tetraacetic (EDTA) -Na 2% anticoagulant. Plasmele au fost separate prin centrifugare (800 g, 20 4 minute) într-o microcentrifugă Eppendorf 5402 refrigerată (Brinkman Instr., NY, SUA) și au fost păstrate într-un frigider Mabe RMT, 41XMVEB (Columbia). Odată ce s-a obținut proba de sânge, animalele au fost eutanasiate sub anestezie ușoară cu eter. Ficatul a fost disecat, aspectul său macroscopic a fost evaluat și a fost plasat în 250 mM tampon Tris-zaharoză pH 7,2 la 4 ° C. 1,5 g de ficat s-au omogenizat cu o greutate de 3 ori mai mare în tampon Tris-zaharoză la 4 ° C într-un olar NSI-12 Bodine (Electric Comp., Chicago, SUA). Supernatantul omogenatului, diluat 1:40 cu apă deionizată, a fost menținut la frigider până la aplicarea analizelor respective.

Determinarea amplorii și caracteristicilor HG: O mică porțiune de ficat fixată în 10% formalină tamponată a fost utilizată pentru studiul său histopatologic efectuat în laboratorul de anatomie patologică al Spitalului veterinar „Dr. Humberto Ramnrez Daza ”de la DCV-UCLA. Secțiuni de 4 microni ale țesutului au fost obținute folosind un microtom Jung AG (Heidelberg, Germania) și colorarea ulterioară a secțiunilor cu hematoxilină-eozină conform tehnicii convenționale.

Cantitatea de depozit de grăsime hepatică: În supernatantul diluat al omogenatului hepatic, concentrația trigliceridelor a fost determinată prin metoda enzimatică utilizând un kit Qualitest (Ind. Qualitest, Caracas, Venezuela). Rezultatele au fost exprimate în miligrame (mg) de trigliceride/mg de proteine, care au fost determinate folosind setul Pierce (ILL, SUA) pe baza tehnicii Bradford [5].

Cuantificarea produselor de degradare lipoperoxidativă: În supernatantul omogenatului hepatic, s-a determinat concentrația dienelor conjugate (DC), prin tehnica descrisă de Wallin [22] și, de asemenea, concentrația de malondialdehidă (MDA) prin intermediul TBARS (reactanți cu acid barbituric 2-tio) conform Ohkawa [21].

Determinarea afectării funcției hepatice: În plasmă, activitatea alaninei aminotransferazei (ALT) și a aspartatului aminotransferazei (AST) au fost determinate folosind truse comerciale (laboratorul Wiener, Rosario, Argentina). Toate citirile spectrofotometrice au fost efectuate pe un Genesys 5 (NY, SUA).

Analiza statistică a rezultatelor: a fost realizată cu ajutorul software-ului statistic SPSS (pachetul statistic pentru științele sociale sau soluții statistice de produse și servicii) versiunea 17.0 pentru Windows. Rezultatele au fost exprimate ca medie a valorilor ± eroare standard. Pentru a stabili semnificația statistică a rezultatelor, s-a folosit testul „t” al Studentului, necesitând o certitudine de 95% (P REZULTATE ȘI DISCUȚIE

În FIG. 1A prezintă aspectul macroscopic al ficatului mascul de șoarece RMN adult controlat cu o nuanță închisă și în FIG. 1B ficatul unui animal injectat cu DL-etionină, care are o culoare deschisă spre deosebire de animalul martor. Studiul histologic al ficatului șoarecilor RMN masculi adulți martori a arătat celule hepatice cu aspect normal (FIG. 1C). Cu toate acestea, în ficatul șoarecilor tratați cu DL-etionină, s-a observat metamorfoză moderată a grăsimii hepatice, cu vacuole citoplasmatice mari și mici în hepatocite și prezența megalocitelor și a celulelor inelare sigilate (FIG. 1D).

Stresul oxidativ: cuantificarea prin DC și MDA

Stresul oxidativ a fost cuantificat prin nivelurile hepatice de diene conjugate (DC) și malondialdehidă (MDA). S-a observat că DC au fost semnificativ crescute (P, CONCENTRAREA FICATULUI DE: (2A) DC ȘI (2B MDA ÎN CONTROLUL ADULȚI NMRI BĂRBAȚI ȘI CU HG INDUIT DE DL-ETIONINĂ (7,5 MG/20 G GREUTATEA CORPULUI). S DE 10 ANIMALE/GRUP; * P

Depozit hepatic: cuantificarea trigliceridelor

Ficăcii șoarecilor masculi injectați cu DL-etionină au prezentat o creștere semnificativă (CONCENTRAȚIA P HEPBTIC TG LA CONTROLUL ADULȚI NMRI DE BĂRBAȚI ȘI LA ȘOARELII DL-ETIONINA INDUȚI CU HG (7,5 MG/20 G GREUTATE CORPORALĂ). 10 ANIMALE/GRUP; ** P

Deteriorarea funcției hepatice: cuantificare ALT și AST

Administrarea DL-etioninei la șoareci RMN masculi adulți a fost semnificativ crescută (P ACTIVITATEA PLASMBTICĂ A ALT ȘI AST TRANSAMINAZE LA ȘOARELE ADULTE CONTROLATE CU HG INDUIT DE DL-ETIONINĂ (7,5 MG/20 G GREUTATE CORPORALĂ). 10 ANIMALE/GRUP; ** P

HG poate fi una dintre principalele modificări metabolice ale bovinului peripartum [23]. Administrarea colinei la vacile proaspete previne HG [17].

Modelele experimentale pentru investigarea NAFLD la animalele de laborator [20] nu au furnizat doar contribuții importante în ceea ce privește aspectele deja indicate, ci și în ceea ce privește utilizarea agenților terapeutici, în special a produselor naturale. În studiul de față, șoarecii adulți RMN masculi au fost folosiți ca model experimental în care NAFLD a fost indus de i.p. (7,5 mg/20 g greutate corporală) de DL-etionină, un analog etilic al metioninei (Met) care deplasează aminoacidul din căile sale metabolice normale, inducând o scădere a ATP hepatic a sintezei proteinelor și scăderea consecventă, printre altele, de la lipoproteine ​​cu densitate foarte mică (VLDL), care exportă lipide din ficat în sânge. Trebuie remarcat faptul că Met este transformat în ficatul animalului prin acțiunea enzimei Met-adenosiltransferază care catalizează conversia sa în S-adenosil-Met [14].

Studiul histopatologic al ficatului șoarecilor masculi administrați cu DL-etionină, a dus la o metamorfoză hepatică moderată a grăsimii, cu hepatocite ale căror citoplasme prezentau vacuole mari și mici, pe lângă prezența megalocitelor și a celulelor inelului sigiliu. Aceste rezultate sunt în concordanță cu cele raportate la șobolanii Sprague Dawley masculi, hrăniți cu o dietă îmbogățită cu fructoză timp de cinci săptămâni, care au prezentat modificări histopatologice la nivelul ficatului, caracterizate prin depuneri grase ușoare până la moderate macro și microvesiculare, cu semne minime de fibroză perisinusoidală. [Două ]. Pe de altă parte, adăugarea în dietă a 0,5% niacină, un agent terapeutic în tratamentul dislipidemiei și bolilor cardiovasculare, inversează hepatosteatoza indusă de o dietă bogată în grăsimi administrată șobolanilor Sprague Dawley masculi caracterizați prin micro și macrosteatoză proeminentă cu vacuole intrahepatice cu diametrul de 4-10 mm [11].

Boala hepatică grasă nealcoolică este probabil cea mai frecventă cauză a aminotransferazelor serice crescute, în lumea occidentală și, de asemenea, în lumea asiatică [4]. Afectarea hepatică acută sau cronică este invariabil asociată cu transaminaze plasmatice crescute alanina aminotransferază (ALT), o enzimă cu localizare intracelulară în principal citoplasmatică și a aspartatului aminotransferazei (AST), situată în două regiuni intracelulare și mitocondriale ale celulei și mitocondriilor. cea mai mare concentrație în ficat și creșterea acestuia este văzută ca specifică pentru afectarea ficatului [12].

În prezentul studiu, s-a observat cum la șoarecii masculi RMN injectați cu DL-etionină, activitățile plasmatice ale ALT și AST s-au dovedit a fi semnificativ crescute în comparație cu martorii lor respectivi. Aceste rezultate coincid cu alte rapoarte care arată că CCl4, un hepatotoxic puternic, induce o creștere a parametrilor serici ai afectării ficatului, cum ar fi enzimele ALT și AST la șobolanii masculi albini ai tulpinii Wistar [1]. În plus, administrarea CCl4 la șoarecii masculi Kunming provoacă hepatotoxicitate acută evidențiată de o creștere semnificativă a ALT și AST serice și a antioxidanților hepatici [7]. Raportul AST/ALT poate ghida diagnosticul în ceea ce privește tipul de hepatosteatoză produsă, astfel o valoare mai mare de 2 face ca HG de natură alcoolică să fie probabilă [12]. În studiul de față, s-a obținut o valoare AST/ALT de 1,4 la șoareci masculi cu HG, rezultate în concordanță cu natura sa nealcoolică.

Conform rezultatelor obținute în prezenta investigație, administrarea la șoareci masculi prin i.p. DL-etionina în doză de 7,5 mg/20 g greutate corporală induce un ficat gras nealcoolic (NAFLD) caracterizat prin metamorfoză hepatică moderată a grăsimii și o depunere crescută de trigliceride în ficat. NAFLD indus de etionină a provocat o stare de stres oxidativ hepatic și valori crescute ale ALT și AST plasmatice, indicând disfuncție hepatică.

Autorii mulțumesc Consiliului pentru Dezvoltare Științifică, Umanistică și Tehnologică a Universității Centroccidentale "Lisandro Alvarado" (UCLA, Venezuela), pentru finanțarea acordată acestui studiu.

1. ABDEL-MONEIM, A.M.; AL-KAHTANI, MA; EL-KERSH, MA; AL-OMAIR, M.A. Acțiunile antiinflamatoare/anti-fibrotice și hepatoprotectoare ale taurinei și silimarinei împotriva radicalilor liberi împotriva inducerii leziunilor hepatice de șobolan induse de CCl4. Plus unu. 10 (12): e0144509. 2015.

2. ACKERMAN, Z.; ORON-HERMAN, M.; GROZOVSKI, M.; ROSENTHAL, .T; PAPPO, O.; LINK, G.; SELA, B.A. Afecțiuni hepatice grase induse de fructoză Efectele hepatice ale tensiunii arteriale și ale reducerii trigliceridelor plasmatice. Hipertensiune 45 (5): 1012-1018. 2005.

3. AHMAD, D.; GULFRAZ, M.; AHMAD, MS; NAZIR, H.; GUL, H.; ASIF, S. Acțiunea de protecție a Taraxacum officinale asupra hepatotoxicității induse de CCl4 la șobolani. Afr. J. Pharm. Farmacol. 8 (30): 775-780. 2014.

4. ALAM, S.; NOOR-E-ALAM, S.M.; CHOWDHURY, Z.R.; ALAM, M.; KABIR, J. Steatohepatita nealcoolică la pacienții cu boală hepatică grasă nealcoolică din Bangladesh. Lumea J. Hepatol. 5 (5): 281-287. 2013.

5. BRADFORD, M.A. O metodă rapidă și sensibilă pentru cantitățile de micrograme de proteine ​​care utilizează principiul legării de proteine-coloranți. Analitică. Biochimie. 72: 248-254. 1976.

6. BRAUNERSREUTHER, V.; VIVIANI, G.L.; MACH, F.; MONTECUCCO, F. Rolul citokinelor și chemokinelor în boala hepatică grasă nealcoolică. Lumea J. Gastroenterol. 18 (8): 727-735. 2012.

7. CHEN, P.; CHEN, Y.; WANG, Y.; CAI, S.; DENG, L.; LIU, J.; ZHANG, H. Evaluarea comparativă a activităților hepatoprotectoare ale genipozidului, crocinelor și crocetinei prin leziuni hepatice induse de CCl4 la șoareci. Biomol. Ther. (Seul). 24 (2): 156-162. 2016.

8. DONTHAMSETTY, S.; BHAVE, V.S.; MITRA, MS; LATENDRESSE, J.R.; MEHENDALE, H.M. Ficatul gras nealcoolic sensibilizează șobolanii la hepatotoxicitatea cu tetraclorură de carbon. Hepatol. 45 (2): 391-403. 2007.

9. FABBRINI, E.; MOHAMMED, B.S.; MAGKOS, F.; KORENBLAT, K.M.; PATTERSON, B.W.; KLEIN, S. Alterări ale țesutului adipos și ale cineticii lipidelor hepatice la bărbații și femeile obeze cu boli hepatice grase nealcoolice. Gastroenterol. 134 (2): 424-431. 2008.

10. FONDUL NAȚIONAL PENTRU ȘTIINȚĂ, TEHNOLOGIE ȘI INOVAȚIE (FONACIT). Standard pentru utilizarea animalelor în cercetare. În: Codul de bioetică și biosecuritate. Ed. 3 Caracas, Venezuela. Pp 33-35. 2009.

11. GANJI, S.H.; KUKES, G.D.; LAMBRECHT, N.; KASHYAP, ML.; KAMANNA, V.S. Rolul terapeutic al niacinei în prevenirea și regresia steatozei hepatice la modelul de șobolan al bolii hepatice grase nealcoolice. Am. J. Physiol. Gastrointest. Fiziol hepatic. 306 (4): G320-G327. 2014.

12. GIANNINI, E.G.; TESTA, R.; SAVARINO, V. Modificarea enzimelor hepatice: Un ghid pentru clinicieni. Câine. Conf. Univ. J. 172 (3): 367-379. 2005.

13. LУPEZ-ORTEGA, A.A.; ARANGUREN, A.J.; PLAZA, MA; MURILLO, M.D. Stresul oxidativ și funcția hepatică anormală la șoarecii femele cu ficat gras experimental. Pr. Veterinar. 25 (1): 7-11. 2014.

14. MATO, J.M; БVILA, M.A.; CORRALES, F.J. Biosinteza S-adenosilmetioninei. În: Carmel, R., Jacobsen, D.W. (Eds), Homocisteina în sănătate și boală. Cambridge University Press. Cambridge. Pp. 47-62. 2001.

15. MAYES, P.A. Transportul și depozitarea lipidelor. În: Murray, R.K.; Granner, D.K.; Mayes, PA; Rodwell V.W. (Eds), Harper® Biochimie. Ediția a 25-a, Appleton & Lange, Stamford. Pp 268-284; 130-136. 2000.

16. NITANAI, A.; KATOH, N.; OIKAWA, S.; SAITOH, M.; HAMADA, M.; KUTSUZAWA, A.; MOHAMED, T.; UCHIDA, E.; ENDOH, D.; KUROSAWA, T.; SATO, H. Scăderea concentrației serice a apolipoproteinei C-III la vacile cu ficat gras indus de etionină. J. Veterinar. Med. Sci. 66 (9): 1113-1118. 2004.

17. ROVERS, M, Cetoza la vacile de lapte și rolul dealului. MG Mundo Ganad. 5 (257): 58-60. 2014.

18. SINGAL, A.K.; JAMPANA, S.C.; WEINMAN, S.A. Antioxidanții ca agenți terapeutici pentru afecțiunile hepatice. Ficat. Internat. 31 (10): 1432-1448. 2011.

19. SUTHAR, V.S.; CANELAS-RAPOSO, J.; DIN NIZA .; HEUWIESER, W. Prevalența cetozei subclinice și relațiile cu bolile postpartum la vacile de lapte europene. J. Dairy Sci. 96 (5): 2925-2938. 2013.

20. TAKAHASHI, Y.; SOEJIMA, Y.; FUKUSATO, T. Modele animale de boală hepatică grasă nealcoolică/steatohepatită nealcoolică. Lumea J. Gastroenterol. 18 (19): 2300- 2308. 2012.

21. OHKAWA, H.; OHISHI, N.; YAGI K. Test pentru peroxizii lipidici în țesuturile animale prin reacția acidului tiobarbituric. Analitică. Biochimie. 95 (2): 351-358. 1979.

22. WALLIN, B.; ROSENGREN, B.; SHERTZER, H.; CAMEJO, G. Oxidarea lipoproteinelor și măsurarea formării substanțelor care reacționează cu acid tiobarbituric pe o singură placă de microtitrare: utilizarea sa pentru evaluarea antioxidanților. Analitică. Biochimie. 208 (1): 10-15. 1993.