Atenție: această pagină este o traducere a acestei pagini inițial în engleză. Vă rugăm să rețineți, deoarece traducerile sunt generate de mașini, nu că toate traducerile vor fi perfecte. Acest site web și paginile sale sunt destinate citirii în limba engleză. Orice traducere a acestui site web și a paginilor sale web poate fi imprecisă și inexactă în totalitate sau parțial. Această traducere este oferită ca o comoditate.

tehnici

Tehnicile de inginerie a proteinelor sunt o parte esențială a personalizării sau producției de proteine ​​cu proprietăți specifice care pot fi aplicate în diferite procese industriale. Astfel, acestea sunt cruciale pentru cercetarea biotehnologiei.

Cu toate acestea, aceste metode se bazează în mare măsură pe capacitatea de a izola și purifica proteinele dorite pentru a înțelege proprietățile lor fizice și chimice, împreună cu structurile lor terțiare și interacțiunile cu liganzi și substraturi.

Intensitatea la care se urmărește acest proces de purificare depinde de utilizarea la care trebuie pusă proteina. De exemplu, proteinele farmaceutice și alimentare trebuie să fie aduse la o pantă de puritate ridicată și să parcurgă mai multe etape secvențiale, posibil în mod unic, deoarece în fiecare etapă unele proteine ​​vor fi inevitabil pierdute.

Purificarea moleculelor de proteine ​​este mai simplă decât purificarea complexelor proteice.

Pasul 1: Creați un extract din proteina brută

Extractele brute de proteine ​​intracelulare sunt preparate prin lizarea celulei utilizând procese chimice sau mecanice. Resturile sunt apoi îndepărtate prin centrifugare. Supernatantul rezultat este departe de forma pură, fiind amestecat cu multe alte macro și micromolecule.

Proteinele extracelulare se obțin prin centrifugarea soluției și îndepărtarea celulelor. O metodă specifică pentru obținerea unui extract brut de enzime termostabile este încălzirea amestecului pentru denaturarea altor proteine ​​și apoi răcirea acestuia pentru a reforma proteinele termostabile de interes, centrifugându-l în cele din urmă pentru a elimina proteinele denaturate.

Pasul 2: purificare intermediară

Sărare

Proteinele dintr-un extract brut sunt apoi purificate prin precipitarea lor într-o soluție de sare foarte concentrată, cum ar fi sulfatul de amoniu. Acest lucru funcționează pe baza solubilității mai scăzute a proteinei la concentrații mari de sare. Cu toate acestea, toate proteinele nu precipită la aceeași concentrație de sare, ceea ce înseamnă că sărarea ajută și la descompunerea proteinelor. Poate fi folosit și pentru concentrarea proteinelor în soluție. Această etapă crește puritatea de trei ori și 92% din proteina din soluție este recuperată.

Dializă

Proteinele sunt molecule mari și acest lucru înseamnă că sărurile proteinelor vor fi conservate prin trecerea soluției printr-o membrană semipermeabilă. Celuloza este o membrană tipică de dializă. Dializa nu poate fi utilizată pentru a separa proteinele de diferite greutăți moleculare.

Cromatografie

Alte tehnici utilizate pentru îndepărtarea proteinelor sărate includ cromatografia și filtrarea cu excludere pe gel. Acestea sunt acum disponibile ca kituri preformate pentru multe proteine ​​standard și sunt adesea potrivite pentru procese pe scară largă.

Filtrarea pe gel funcționează pe baza separării mărimii printr-o coloană a modelelor poroase ale polimerului, cum ar fi dextran sau agaroză. Moleculele mari pot curge numai prin spațiile dintre mulaje, în timp ce moleculele mai mici ocupă aceste spații și spațiul din interiorul mulajelor, reducându-le. Astfel, eluantul conține moleculele emergente în ordinea mărimii lor, de la cea mai mare la cea mai mică. Se utilizează, de asemenea, tehnici de cromatografie cu fază inversă sau cu schimb de ioni, care funcționează pe baza proprietăților hidrofobe diferențiate și respectiv a sarcinii. Cromatografia inversă poate fi limitată în utilizarea sa din cauza unei posibile denaturări a proteinei de către solvenți organici.

Dializa și schimbul de ioni au ca rezultat o soluție de 9 ori mai pură, dar cu doar 77% din proteina originală care este acum disponibilă. După cromatografia de excludere pe gel, randamentul este de numai 50%, dar puritatea este de o sută de ori.

Pasul 3: purificarea finală

Cromatografia de afinitate

Acest proces depinde de utilizarea liganzilor legați la perle care se leagă în mod specific de proteina de interes care poate fi apoi clătită cu o altă soluție de liganzi liberi. Acest lucru are ca rezultat probe de proteine ​​extrem de pure, care au cea mai mare activitate specifică dintre toate tehnicile utilizate în prezent. Un exemplu este purificarea concanavilinei A utilizând reziduurile de glucoză atașate la margele dintr-o coloană. Soluția este acum de 3000 de ori mai pură, dar randamentul este de doar 35% din proteina originală.

Electroforeza pe gel de poliacrilamidă

Electroforeza pe gel de poliacrilamidă este utilizată pentru a descoperi puritatea probei de proteine ​​după fiecare etapă în funcție de mărime. Încărcarea netă pe moleculă determină căderea coloanei sau a foii de gel într-un câmp electric, permițând proteinelor să se separe în funcție de rata de migrație a acestora, care la rândul ei depinde de încărcarea lor, precum și de frecare și forța câmpului. Gelul acționează ca un filtru chimic inert și ușor de format, moleculele de proteine ​​fiind aproape imobile în coloană, deoarece acestea aderă între porii mult mai mici dintre moleculele de gel. O serie de benzi sunt vizualizate inițial reprezentând diverse proteine ​​din amestec, care se reduc treptat în număr mare până când etapa finală arată o singură bandă.

Imunoblotarea

Imunoblotarea este o altă tehnică utilă, adesea combinată cu cromatografia de afinitate. Folosește anticorpii astfel încât proteina să fie izolată ca liganzi în coloană. Anticorpul este uneori supus izotopilor sau coloranților pentru a-i marca și pentru a facilita detectarea după separare.

Orice tehnică cromatografică este perfecționată folosind presiune pentru a forța soluția printr-o coloană de materiale fin împărțite, mulaje încărcate sau cu ligand. Suprafața crescândă are ca rezultat cea mai mare interacțiune care împinge rezoluția și viteza tehnicii în sus. Aceasta este denumită cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC).

Toți acești pași sunt incluși în schema ideală, care ar trebui să se concentreze pe nivelurile de randament și purificare pentru a furniza cantități adecvate de proteine ​​pentru a rula printr-un experiment, precum și pentru a oferi suficientă puritate pentru a face interpretarea relativ simplă.

Referințe

Lecturi suplimentare

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas este OB-GYN, care a absolvit Colegiul Medical al Guvernului, Universitatea din Calicut, Kerala, în 2001. Liji a practicat ca consultant cu normă întreagă în obstetrică/ginecologie într-un spital privat pentru câțiva ani după absolvire. . Ea a consiliat sute de pacienți care se confruntă cu probleme legate de sarcină și infertilitate și a fost responsabilă de peste 2.000 de nașteri, depunând eforturi pentru a obține o livrare normală mai degrabă decât operativă.

Citații

Vă rugăm să utilizați unul dintre următoarele formate pentru a cita acest articol în eseu, lucrare sau raport:

Thomas, Liji. (2019, 26 februarie). Tehnici de purificare a proteinelor. Știri-Medical. Adus pe 12 ianuarie 2021 de pe https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

Thomas, Liji. „Tehnici de purificare a proteinelor”. Știri-Medical. 12 ianuarie 2021. .

Thomas, Liji. „Tehnici de purificare a proteinelor”. Știri-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (accesat la 12 ianuarie 2021).

Thomas, Liji. 2019. Tehnici de purificare a proteinelor. News-Medical, vizualizat la 12 ianuarie 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

News-Medical.Net furnizează acest serviciu de informații medicale în conformitate cu acești termeni și condiții. Vă rugăm să rețineți că informațiile medicale găsite pe acest site web sunt concepute pentru a sprijini, nu pentru a înlocui relația dintre pacient și medic/medic și sfaturile medicale pe care le pot oferi.

News-Medical.net - Un site AZoNetwork