Text completat

(1) FACULTATEA DE ȘTIINȚE BIOCHIMICE ȘI FARMACEUTICE UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO. Institutul de Biologie Moleculară și Celulară din Rosario. Teză de doctorat în științe biologice. Recunoașterea selectivă a senzorului/operatorului în regulatoarele de răspuns metalice monovalente din Salmonella enterica. Prezentat de: Lic. María Victoria Humbert Director: Dr. Fernando C. Soncini. Rosario, Argentina 2014.

selectivă

(2) 1. Recunoașterea selectivă a senzorului/operatorului în regulatoarele de răspuns metalice monovalente din Salmonella enterica. María Victoria Humbert Licențiată în biotehnologie Facultatea de Științe Biochimice și Farmaceutice Universitatea Națională din Rosario. Această teză este prezentată ca parte a cerințelor pentru calificarea la diploma academică de doctor în științe biologice, de la Universitatea Națională din Rosario și nu a fost prezentată anterior pentru a obține o altă diplomă la această sau la o altă universitate. Conține rezultatele obținute în cercetările efectuate la Institutul de Biologie Moleculară și Celulară din Rosario (IBR-CONICET), zona Biologie moleculară a microorganismelor patogene, dependentă de Facultatea de Științe Biochimice și Farmaceutice, în perioada cuprinsă între 04 iunie 2009 și 27 martie 2014, sub îndrumarea doctorului Fernando C. Soncini.

(3) 2. Familia și prietenii mei.

(6) Index. ABREVIERI DE INDICE. 10. INTRODUCERE. 13. 1. Genul Salmonella 1.1. Ciclul infecțios cu Salmonella și supraviețuirea în mediu. 14 15. 2. Genul Escherichia. 16. 3. Salmonella enterica și Escherichia coli ca modele de studiu. 17. 4. Regulatoare transcripționale. 18. 4.1. Familia MerR de regulatori transcripționali. 18. 4.2. Structura autorităților de reglementare din familia MerR. 19. 4.2.1 Domeniul HTH: un numitor comun în regulatorii de transcripție 4.3. Regulatorii MerR și interacțiunea lor cu ADN-ul. 20 23. 4.3.1 Regulatori tip MerR: paradigmă clasică a reglementării transcripționale 4.3.2 Regulatori MerR neconvenționali. 23 26. 4.3.2.1 Regulatoare CarA/CarS. 28. 4.3.2.2 Regulatoare LitR. 31. 4.3.2.3 Regulatoare MlrA. 32. 4.3.2.4 Regulatoare BluR. 37. 4.3.2.5 Regulatoare Hsp_2. 37. 5. Metale: esențiale, neesențiale și toxice. 38. 5.1. Clasificarea metalelor. 38. 5.2. Strategii de homeostazie/rezistență la metalele de tranziție. 39. 6. Homeostazia cuprului 6.1. 6.2. Homeostazia cuprului în E. coli. 40 41. 6.1.1 Regulamentul tacului. 42. 6.1.2 Regulon cus. 43. 6.1.3 Sistemul alternativ de rezistență la cupru PcoABCD. 44. Homeostazia de cupru în Salmonella 6.2.1 Regulonul tacului. 45 45. 5.

(10) Index. 2.1. Nivelurile ridicate de STM1266 scad motilitatea. 149. 2.2. Expresia excesivă a STM1266 stimulează formarea de biofilme. 150. 2.3. Inducerea STM1266 crește producția și secreția. 2.4. de celuloză. 152. Nivelurile ridicate de STM1266 conferă rezistență la streptomicină. 153. 3. STM1266 și implicația sa în reglarea formării biofilmului. 155. Discuție. 158. 1. Analiza comparativă a reglării transcripționale a csgD la E. coli și S. enterica. 159. 2. Proteine ​​cu domenii GGDEF: reglare pozitivă a csgD. 164. 3. Proteine ​​cu domenii EAL: reglare negativă a csgD. 166. CONCLUZII GENERALE. 168. REZUMAT. 174. REFERINȚE BIBLIOGRAFICE. 176. 9.

(11) Abrevieri. Abrevieri A. Amperi. Abs. Absorbanta ADN. Acidul dezoxiribonucleic. AHL. N-acil-homoserină lactonă. Amp. Ampicilina. ARN. Acid ribonucleic. ARNPol. ARN polimeraza. ATP. Adenozină 5 'trifosfat. BCIP. 5-brom, 4-clor, 3-indofosfat. BSA. Albumină serică bovină. Cbl. Cobalamină. c-di-GMP. bis- (3 '; 5') -guanozin monofosfat ciclic. Cf. Concentrația finală. Ci. Curie. CIM. Concentrație minimă inhibitoare. Cm. Cloramfenicol. C-terminal. Carboxil-terminal. DGC. Diguanylate cyclase. DNază I. Deoxiribonuclează I. DTT. Ditiotreitol. CE. Escherichia coli. EGTA. Etilen glicol bis (β-aminoetil eter) acid N, N, N ', N'-tetraacetic. EMSA. Test de întârziere a mobilității electroforetice. Strep. Streptomicină. Fw. Direct. 10.

(12) Abrevieri g. Gram. g/l. Gramele pe litru. HPLC. Cromatografie lichidă de înaltă presiune. HTH. Helix-turn-helix. IPTG. Izopropil β-D-tiogalactopiranozidă. kA. Constanta de echilibru (asociere). kb. Kilobase. kD. Constanta de echilibru (disociere). Km. Kanamicină. LIVRE. Luria Bertani. NB. Bulion de nutrienți. NBT. Albastru nitrotetrazoliu. nt. Nucleotidă N-terminal. Amino-terminal. ONPG. O-nitrofenil-galactopiranozidă. ORF. Deschideți cadrul de citire. p. Plasmid. P. Promotor. pb. Perechi de baze. PCR. Reacție în lanț a polimerazei. PDE. Fosfodiesterază. (p) ppGpp. Pentafosfat de guanozină. p/v. Greutate în volum. r. Anizotropie fluorescentă. A. Rezistent. RMN. Rezonanță magnetică nucleară. rpm. Rotaţii pe minut. unsprezece.

(13) Abrevieri Rv. Înapoi. SDS. Dodecil sulfat de sodiu. SN. Supernatant. STM. Salmonella Typhimurium. Tc. Tetraciclină. Unitatea U. sau. a . Unități arbitrare. U. M . Unități Miller. UFC. Unități care formează colonii. UV. Ultraviolet. V. Volți. Vf. Volumul final. v/v. Volum cu volum. wHTH. Helix-spirală înaripată. X-gal. 5-brom-4-clor-3-indolil-β-D-galactopiranozidă. α. Helix-α. β. Foaie-β. Δ. Ștergere 12.

(25) Introducere. (Zheleznova Heldwein și Brennan, 2001). Interacțiunea regulatorului cu coactivatorul său nu afectează semnificativ afinitatea acestuia pentru ADN. În schimb, provoacă o alterare conformațională care se transmite intramolecular la domeniul de legare a ADN-ului și are ca rezultat în cele din urmă relaxarea curburii și desfacerea ADN-ului în secvența operatorului, rezultând realinierea casetelor -35 și -10, formarea complexului deschis de RNAPol și inițierea consecventă a transcrierii (Fig. 5) (Ansari și colab., 1992; Outten și colab., 1999; Zheleznova Heldwein și Brennan, 2001; Newberry și Brennan, 2004). desfacerea ADN-ului își are originea în slăbirea legăturilor de hidrogen ale perechii de baze AT care se găsește în general în centrul diadei simetrice a operatorului, permițând o distorsiune în centrul acestuia. Această schimbare a bazei ar fi stabilizată prin interacțiunea dintre reziduurile de proteine ​​și coloana vertebrală a fosfatului ADN-ului. Deoarece identitatea perechii de baze centrale a secvenței palindromice este conservată ca adenină sau timină la majoritatea promotorilor MerR și adăugată la faptul că acestea nu afectează afinitatea regulatorului. 24.

(27) Introducere. 4.3.2 Regulatori MerR neconvenționali Studii recente efectuate pe membri mai diferiți ai acestei familii, precum CarA, LitR, MlrA, BluR și HspR_2, arată mecanisme de interacțiune cu ADN care sunt diferite de modelul de acțiune unificat menționat în secțiunea anterioară. . În acest nou set de regulatori, regulatorul ar putea acționa fie ca activator, fie ca represor al genelor lor țintă. Modelul de acțiune ar include, de asemenea, participarea altor proteine ​​reglatoare care ar concura pentru interacțiunea regulatorului de tip MerR pentru ADN sau ar împiedica interacțiunea acestuia cu secvența operatorului, unindu-se direct la domeniul de legare a ADN-ului printr-o interacțiune proteică. -proteină și, astfel, deplasează regulatorul MerR de la locul său țintă. Mai mult, o analiză comparativă a secvențelor operatorului țintă recunoscute de regulatorii atipici MerR (Fig. 7-B) relevă diferențe semnificative cu cei recunoscuți ca operatori caracteristici ai acestei familii, invalidând posibilitatea stabilirii unor reguli generale care să descrie un mecanism structural și funcțional comun. între toți regulatorii de transcripție MerR.

(28) Introducere. În cazul particular al operatorilor recunoscuți de regulatorii MerR neconvenționali, diada simetrică este situată decalată de la casetele -35 și -10, în general suprapuse pe caseta -35 sau în amonte de aceasta (Fig. 7-B). Această caracteristică structurală, neobișnuită în majoritatea operatorilor MerR (Fig. 7-A), indică faptul că modelul de reglare mecanicistă, în general reprimarea, ar fi diferit de cel propus pentru regulatoarele de tip MerR convenționale sau tipice. În regulatoarele neconvenționale, nu ar depinde de reconfigurarea conformațională a operatorului și de repoziționarea casetelor -35 și -10 mediate de regulator, sugerând două modele de reglementare diferite în cadrul acestei familii de regulatoare. 27.

(29) Introducere. Înrudit filogenetic și similar din punct de vedere structural, în special la nivelul domeniului de legare a ADN-ului N-terminal (Fig. 8). 4.3.2.1 Regulatori CarA/CarS În cadrul grupului de regulatori de transcripție MerR atipici se disting regulatorii de tip CarA/LitR, care prezintă în domeniul lor C-terminal un motiv de legare la cobalamină (vitamina B12). Acestea sunt implicate în reglarea transcripțională modulată în lumină într-o mare varietate de bacterii non-fototrofice (Actinobacterii și bacterii Gram-negative, cum ar fi Pseudomonas, Shewanella și Vibrio). Inhibarea stresului foto-oxidativ prin producerea de carotenoizi, pigmenți galbeni, portocalii sau roșii care protejează celula de daunele cauzate de radicalii liberi de oxigen, este o caracteristică fiziologică fotodependentă foarte caracterizată la multe bacterii non-fototrofe. Un grup important de specii bacteriene acumulează această clasă de pigmenți atunci când sunt iluminate. Acest lucru sugerează conservarea evolutivă a unui anumit sistem de reglementare care traduce un semnal luminos în expresia genelor necesare pentru biosinteza carotenoidelor. Detaliile acestor sisteme de reglementare sunt încă necunoscute.

(35) Introducere. Biosinteza indirectă de celuloză prin activarea transcripțională a AdrA. Această proteină are activitate de diganilat ciclază, motiv pentru care este capabilă să stimuleze producția de bis- (3 ', 5') -guanozin monofosfat ciclic (c-di-GMP), o moleculă de semnal bacterian omniprezentă. Acest metabolit acționează apoi ca un mesager secundar crucial pentru biosinteza celulozei și probabil a altor exopolizaharide (Fig. 12-A). Reglarea CsgD este considerată cheie în luarea deciziilor între forma de viață planctonică și formarea biofilmelor. MlrA nu este singurul factor implicat în reglarea transcripțională a csgD, dar există și alți regulatori care modulează expresia csgD în condiții de inducere foarte diferite: în timpul fazei de creștere staționară din cauza lipsei de nutrienți, în microaerobioză, în aerobioză în mediu minim, la pH alcalin (pH 8,5), osmolaritate scăzută și după temperatură (28 ° C). De aceea, promotorul csgD este recunoscut ca unul dintre cei mai complexi promotori ai E. coli (Gerstel și colab., 2003; Ogasawara și colab., 2010; Ogasawara și colab., 2011). Secvența de legare a MlrA în regiunea promotorului csgD (Fig. 7-B) constă dintr-o repetare inversată de 11 bp cu un interval de 12 bp (caseta MlrA) și este. 3. 4.